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May 02, 2024

Adaptive Phasenkontrastmikroskopie zur Kompensation des Meniskuseffekts

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 5785 (2023) Diesen Artikel zitieren 1055 Zugriffe 1 Details zu altmetrischen Metriken Dieser Artikel wurde aktualisiert. Der Phasenkontrast ist einer der wichtigsten

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 5785 (2023) Diesen Artikel zitieren

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1 Altmetrisch

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Dieser Artikel wurde aktualisiert

Der Phasenkontrast ist eine der wichtigsten mikroskopischen Methoden, um transparente, ungefärbte Zellen sichtbar zu machen. Zellkulturen werden häufig in Mikrotiterplatten kultiviert, die aus mehreren zylindrischen Vertiefungen bestehen. Die Oberflächenspannung des Kulturmediums bildet eine flüssige Linse innerhalb der Vertiefung, wodurch die Phasenkontrastbedingungen in den stärker gekrümmten Randbereichen versagen und die Zellbeobachtung verhindert wird. Die adaptive Phasenkontrastmikroskopie ist eine Methode zur starken Vergrößerung der beobachtbaren Fläche durch optische Kompensation des Meniskuseffekts. Der Kondensorring des Mikroskops wird durch ein durchlässiges LCD ersetzt, um dynamische Änderungen zu ermöglichen. Im Beleuchtungspfad wird ein verformbares, mit Flüssigkeit gefülltes Prisma platziert. Der Oberflächenwinkel des Prismas wird adaptiv geneigt, um das durchgelassene Licht zu brechen, sodass der Tangentialwinkel der Flüssigkeitslinse ausgeglichen werden kann. Neben der Beobachtung des Phasenkontrastbildes ermöglicht ein Strahlteiler die gleichzeitige Betrachtung von Kondensatorring und Phasenringverschiebung. Algorithmen analysieren die Verschiebung, um LCD und Prisma dynamisch anzupassen und Phasenkontrastbedingungen zu gewährleisten. Experimente zeigen eine deutliche Vergrößerung der beobachtbaren Fläche, insbesondere bei kleinen Bohrlochgrößen. Bei 96-Well-Platten kann mehr als das Zwölffache der Fläche unter Phasenkontrastbedingungen anstelle der Standard-Phasenkontrastmikroskopie untersucht werden.

Die erstmals 1932 von Frits Zernike1 vorgeschlagene Phasenkontrastmikroskopie ist eine weit verbreitete Methode zur Beobachtung biologischer Proben, da sie transparente, ungefärbte Zellen sichtbar machen kann2. Durch Interferenz können Phasenverschiebungen des passierenden Lichts sichtbar gemacht werden, um den Kontrast bei halbtransparenten Objekten zu erhöhen.

Seine Einsatzmöglichkeiten sind jedoch durch den Meniskuseffekt begrenzt, der insbesondere Proben in Mikroplatten mit 96 oder mehr Wells betrifft3. Referenzmessungen haben gezeigt, dass bei 6-Well-Platten Phasenkontrastbedingungen in 25 % (235 mm2 von 950 mm2) der Well-Oberfläche zu finden sind. Bei 96-Well-Platten sind es nur 2,3 % (0,84 mm2 von 36,3 mm2)4.

Beim Phasenkontrast handelt es sich um ein Verfahren der Durchlichtmikroskopie, bei dem ein Kondensorring in den Beleuchtungsstrahlengang gestellt wird und das Licht im Objektiv durch einen Phasenring geleitet wird (siehe Abb. 1). Überlappen sich Kondensatorringbild und Phasenring, so entstehen Phasenkontrastverhältnisse. Phasenverschiebungen treten an Übergängen in der betrachteten Probe auf, beispielsweise an Zellgrenzen, die optisch hervorgehoben werden. Phasenkontrastbedingungen lassen sich leicht am „Halo“-Effekt erkennen, bei dem es sich um einen Bereich mit dunklem Hintergrund und hellen Kanten um phasenverschiebende Objekte handelt2,6.

Schematische Darstellung des Beleuchtungspfades in einem Phasenkontrastmikroskop mit unterschiedlichen Wellpositionen. (A) Vereinfachter Lichtweg durch das Mikroskop (nichtaktive Elemente wie Umlenkspiegel und Glasplatten wurden weggelassen). (1) Lichtquelle (2) Kondensorring (3) Kondensorlinse (5) MTP (6) Objektivlinse (7) Phasenring (8) Beweglicher Spiegel (9) Bertrand-Linse (10) Okularlinse (11) Sekundärkamera ( 12) Tubusobjektiv (13) Hauptkamera. Durch Bewegen des Spiegels (8) kann zwischen dem Hauptlichtweg (I) und dem Nebenlichtweg (II) umgeschaltet werden, um die Überlappung von Phasenring und Kondensorring zu beobachten. (B) Licht geht durch die Mitte des Brunnens. (B.1) Überlagerungsbild von Phasenring und Kondensatorring. Sie überschneiden sich vollständig. (B.2) Resultierendes Phasenkontrastbild der Zellkultur. (C) Aufgrund der Krümmung der Oberfläche zum Rand des Bohrlochs hin wird der Lichtstrahl vom Zentrum weg gebrochen. (C.1) Im Überlagerungsbild ist die Abweichung zwischen Kondensatorring (2) und Phasenring (7) sichtbar. (C.2) Das resultierende Zellbild wird somit unter Hellfeldbedingungen aufgenommen. Die Bilder (A.2) und (B.2) wurden mit einem 10x-Objektiv (Nikon CFI Plan Fluor DL ​​10XF) in einem 6-Well-MTP aufgenommen.

Biologische Proben befinden sich normalerweise in einem flüssigen Medium. Eine flache Flüssigkeitsoberfläche ist für eine gute Überlagerung von Kondensatorring und Phasenring unerlässlich, wie in Abb. 1B,C zu sehen ist. Diese Überlagerung von Kondensorring und Phasenring kann mit einer Bertrand-Linse und einer Sekundärkamera beobachtet werden.

Die Zellkultivierung erfolgt häufig in standardisierten Gefäßen wie Mikrotiterplatten (MTP), die aus mehreren Vertiefungen bestehen. Die Oberflächenkrümmung des Kulturmediums in jeder Vertiefung erzeugt durch Kapillarkräfte an der Gefäßwand eine Flüssigkeitslinse, wie in Abb. 1 dargestellt. Die gekrümmte Oberfläche lenkt das einfallende Licht ab und verhindert so eine Überlagerung von Kondensatorring und Phasenring. Insbesondere in den stärker gekrümmten Randbereichen dieser Linse versagt der Phasenkontrast, sodass Zellen in diesen Bereichen nicht abgebildet werden können5,6,7.

Die genaue Form des Meniskus kann durch numerische Integration der Young-Laplace-Gleichung8 angenähert werden. Je kleiner der Durchmesser einer Vertiefung ist, desto größer wird der Einfluss der Kapillarkräfte an der Wand aufgrund des zunehmenden Verhältnisses von Umfang zu Oberfläche. Dadurch verringert sich der Anteil der ebenen Flüssigkeitsoberfläche in der Gefäßmitte3. Die stärkere Krümmung entlang der Ränder des Wells führt zu einem größeren Brechungswinkel, was wiederum die Verzerrung und Verschiebungen des Lichts des Kondensatorrings erhöht, was eine Ringüberlagerung verhindert.

Ziel der adaptiven Phasenkontrastmikroskopie ist es, den beobachtbaren Bereich durch optische Kompensation des Meniskuseffekts stark zu vergrößern. Ziel dieses Aufbaus ist es, den Phasenkontrastbereich eines Bohrlochs auf einen Wert nahe der physikalischen Grenze zu erhöhen, die durch den Oberflächenwinkel für Totalreflexion festgelegt wird9. Die Lösung soll ein kompaktes Gerät sein, das ohne große Vorbereitung an ein handelsübliches Mikroskop angebaut werden kann. Darüber hinaus sollen Standard-Mikrotiterplatten anstelle der in „Konkurrierenden Ansätzen“12 eingeführten Spezialplatten verwendet werden. Eine vollständige Automatisierung des Prozesses ist erwünscht, um ganze Bohrlöcher ohne menschliches Eingreifen abzubilden. Daher stellt dieser Artikel einen vollautomatischen Ansatz vor, der in kommerziell erhältliche Standardmikroskope integriert werden kann.

Aufgrund der Bedeutung phasenkontrastmikroskopischer Aufnahmen von Zellen in Mikrotiterplatten wurden in der Vergangenheit verschiedene Lösungen entwickelt, die sich mit dem Problem des Meniskuseffekts befassen. Diese Ansätze können im Allgemeinen in die folgenden Kategorien eingeteilt werden: Verhinderung der Bildung eines Meniskus, optische Korrektur der Meniskuseffekte in den MTPs, rechnerische Reduzierung des Effekts auf Bildern und Mikroskope, die den Meniskuseffekt optisch kompensieren. Der in diesem Artikel vorgestellte Aufbau gehört zur letzten Kategorie.

Die Möglichkeiten, die Bildung des Meniskus zu verhindern, reichen von hydrophob beschichteten Mikrotiterplatten bis hin zu Deckeln, die die Oberfläche des Lösungsmittels nach unten drücken, so dass sie flach ist. Anstelle direkter Modifikationen der Mikrotiterplatte gibt es Kunststoffeinsätze zur Verwendung in einzelnen Standardvertiefungen10,11,12.

Eine weitere Anwendung sind MTPs mit Deckeln, die so geformt sind, dass sie selbst wie ein Prisma wirken und so die durch den Meniskuseffekt verursachte Beugung kompensieren. Diese Deckel funktionieren jedoch nur für ein bestimmtes Zellmedium mit einem definierten Brechungsindex13,14.

Neben spezieller Hardware gibt es auch rechnerische Ansätze zur Kompensation des Meniskuseffekts, beispielsweise die Kontrastverstärkung durch den Vergleich mehrerer Bilder, beispielsweise auf verschiedenen Z-Ebenen15. Andere Methoden verwenden Hellfeldbilder, die durch Algorithmen der künstlichen Intelligenz modifiziert werden, um phasenkontrastähnliche Bilder zu erzeugen16,17. Diese Bilder erreichen jedoch nicht die gleiche Qualität wie echte Phasenkontrastbilder.

Schließlich gibt es Ansätze zur Kompensation des Meniskuseffekts im Strahlengang des Mikroskops, wie der in diesem Artikel vorgeschlagene. Eine vorgeschlagene Lösung besteht darin, einen virtuellen Kondensatorring entsprechend der Flüssigkeitsoberfläche adaptiv zu verformen und zu verschieben, sodass er nach dem Durchgang durch den Meniskus gebrochen wird, sodass er wieder einem unverzerrten Ring ähnelt. Um den virtuellen Kondensatorring zu erzeugen, wird eine Flüssigkristallanzeige (LCD) verwendet18. Auch dieser Aspekt, nämlich die Verschiebung der Kondensatorringform, wird in dieser Arbeit vorgestellt. Das in dieser Arbeit erläuterte Grundprinzip nutzt zu diesem Zweck jedoch zusätzlich ein verformbares Flüssigkeitsprisma. Es ist durch das europäische Patent EP 3 323 010 B1 geschützt, das Eigentum der Fraunhofer Gesellschaft19 ist.

Ein anderer Ansatz besteht darin, anstelle des LCD einen räumlichen Lichtmodulator in den Strahlengang zu integrieren. Insbesondere reflektierende räumliche Lichtmodulatoren weisen eine sehr hohe Pixeldichte und ein sehr hohes Kontrastverhältnis auf. Allerdings ist ihre Integration deutlich aufwändiger, da die Chipgröße in der Regel deutlich kleiner ist als die darzustellenden Kondensatorringe. Transmissive räumliche Lichtmodulatoren haben ebenfalls eine kleine aktive Fläche, obwohl weitere Möglichkeiten zur Verzerrung des Kondensatorrings bestehen. Anstelle eines räumlichen Lichtmodulators kann auch eine digitale Spiegelvorrichtung verwendet werden20.

Ein weiterer Ansatz besteht darin, den Kondensatorring mechanisch horizontal zu bewegen. Dies gewährleistet den gleichen hohen Kontrast und die gleiche Lichtintensität wie bei der herkömmlichen Phasenkontrastmikroskopie. Allerdings ist es langsam und erfordert eine komplexe Mechanik.

Um das Konzept der adaptiven Phasenkontrastmikroskopie zu beweisen, wurde ein Demonstrator gebaut, der die Hauptkomponenten, einen LCD-Kondensorring und ein mit Flüssigkeit gefülltes Prisma umfasst. Anschließend wurde es für Experimente zum Vergleich der regulären mit der adaptiven Phasenkontrastmikroskopie verwendet. Im Folgenden werden die wichtigsten Details des Setups dargestellt.

Optische Elemente werden in den Strahlengang eines inversen Mikroskops (Ti2 Eclipse, Nikon, Japan) eingefügt. Ein Kompensationsadapter ersetzt die Kondensorringeinheit im Beleuchtungsstrahlengang. Abbildung 2 zeigt einen Überblick über den Aufbau und den schematischen Lichtweg.

Aufbau eines modifizierten Mikroskops und vereinfachter Strahlengang. (A) Aufbau der Elemente innerhalb eines inversen Mikroskops. (a) Lichtquelle (b) Adapter für optische Komponenten (c) MTP (d) Objektiv (e) Hauptkamera (f) Strahlteiler (g) Bertrand-Linse und Sekundärkamera (B) Modifizierter Lichtweg im Vergleich zu dem in dargestellt Abb. 1. Der feste Kondensatorring (2) wurde durch ein transmissives LCD ersetzt. Ein abstimmbares Prisma (4) wird eingeführt. Der bewegliche Spiegel (8) wird durch einen 90/10 Strahlteiler ersetzt. (B.1) Funktionsprinzip der Kompensation unter Berücksichtigung der Brechung an Flüssigkeitsoberflächen (gleicher Brechungsindex in Prisma und Zellmedium angenommen).

Das Licht der Lichtquelle (LED100, Märzhäuser Wetzlar, Deutschland) wird durch ein transmissives LCD (LS055R1SX04, Sharp, Japan), den Kondensor (ELWD, Nikon, Japan), ein anpassbares Prisma, die Probe innerhalb eines MTP und das geleitet Phasenkontrastobjektiv mit integriertem Phasenring (4-fache Vergrößerung: CFI Plan Fluor DL ​​4XF, Nikon, Japan; 10-fache Vergrößerung: CFI Plan Fluor DL ​​10XF, Nikon, Japan). Anschließend durchläuft es den Strahlengang des Mikroskopkörpers. Der Umlenkspiegel vor der Tubuslinse wird durch einen 90/10-Strahlteiler (BS028 – 90:10, Thorlabs, USA) ersetzt. 90 % des Lichts werden durch ein Okular zur Hauptkamera (UI-3360CP-NIR-GL, IDS, Deutschland) geleitet und fokussieren die Zellen im MTP. 10 % werden für die Darstellung des überlappenden Kondensorrings und Phasenrings durch die Standard-Bertrand-Linseneinheit des Mikroskops und eine Sekundärkamera (DFK 33UX265, The Imaging Source, Deutschland) verwendet.

Das Mikroskop ist mit einem motorisierten XY-Tisch (SCANplus IM, Märzhäuser Wetzlar, Deutschland) ausgestattet. Da ein ganzes MTP-Brunnen nicht mit nur einem Bild abgedeckt werden kann, werden mehrere Bilder aufgenommen und dann entsprechend ihrer Position zu einem Bild zusammengefügt21.

Der in Abb. 2B.1 dargestellte Kompensationsadapter besteht aus einem LCD, einer Kondensorlinse und einem anpassbaren Prisma. Das LCD erzeugt eine virtuelle Schwarz-Weiß-Kondensatorringmatrix, deren Position und Form dynamisch angepasst werden kann, um die seitliche Verschiebung \(\Delta\) auszugleichen. Das adaptive, mit Flüssigkeit gefüllte Prisma wird in die Beleuchtung zwischen Kondensor und Probe eingefügt, um den Tangentialwinkel \(\varphi\) der Flüssigkeitslinse auszugleichen.

Das LCD22 kann den Kondensatorring als Hell-Dunkel-Matrix darstellen. Es ermöglicht Ø15,5 mm Öffnungen und eine Verschiebung der Ringmitte um 5 mm in XY-Richtung.

Die Hintergrundbeleuchtung des Displays wurde entfernt und durch eine externe LED ersetzt, um eine höhere Helligkeit zu erreichen. Dies geschah, weil ein hoher Kontrast und eine hohe Pixeldichte den angezeigten Kondensatorring verbessern. Getestet wurden zwei Displays mit unterschiedlichen Pixeldichten, 533 ppi (LS055R1SX04, Sharp, Japan) und 187 ppi (CP11009, QITA, Vereinigtes Königreich). Es stellte sich heraus, dass für eine genaue Darstellung des Kondensatorrings eine höhere Pixeldichte erforderlich ist.

Das adaptive Prisma wurde speziell für diese Anwendung entwickelt. Eine elastische Haut und zwei Glasplatten bilden ein geschlossenes Volumen, in das ca. 10 ml flüssiges Medium eingefüllt werden (Abb. 3C). Die beiden zylindrischen Gläser haben einen Durchmesser von 25,4 mm, eine lichte Öffnung von 22,86 mm und eine Dicke von 1 mm. Beide sind mit BBAR antireflexbeschichtet für sichtbares Licht von 425 bis 700 nm. Aufgrund seiner einfachen Handhabung und Kompatibilität mit anderen Materialien wurde Wasser als flüssiges Medium gewählt. Es hat etwa den gleichen Brechungsindex wie die Zellernährungslösung (beide n ≈ 1,333). Die Brechung an den Oberflächen der Glasplatten (n ≈ 1,5) wird aufgrund ihrer geringen Dicke vernachlässigt.

Prismendesign, Betätigung und geometrische Beziehung. (A) Eine Anordnung der Servos und Ringe, die das Prisma halten (verkehrt herum). (B) Kinematik des adaptiven Prismas. Ansicht von unten. (C) Prismendesign. (D) Kinematisches Modell eines Servolagers. Vorderansicht. (E) Beziehung zwischen Winkeln und Koordinaten, die die Glasplatte in Bezug auf die XY-Ebene beschreiben.

Die Schale wird durch Vergießen der weichelastischen Polyharnstoff-Vergussmasse GM 900-1 mit einer Dicke von 1 mm hergestellt. Nach dem Füllen wurden die Glasflächen dicht verklebt. Das elastische Material ermöglicht Neigungswinkel um den Mittelpunkt der unteren Glasplatte von bis zu 30°. Aufgrund der kinematischen Beziehungen zwischen Prisma und Servos sind die tatsächlichen Neigungswinkel auf etwa 20° begrenzt.

Das Prisma ist in einer Aktuatoreinheit montiert. Die obere Glasplatte wird horizontal gehalten, während die untere Platte über drei Servomotoren geneigt werden kann. Eine Übersicht über die Einheit ist in Abb. 3A dargestellt, während die genauen Servomotorpositionen in Bezug auf die Glasplatte in Abb. 3B dargestellt sind.

Der Drehwinkel für jeden Servomotor, genannt \({\gamma }_{1}\), \({\gamma }_{2}\) und \({\gamma }_{3}\), kann gesteuert werden, um sich in den gewünschten Glasplattenwinkel zu bewegen. Die untere Glasplattenebene wird durch die Winkel \(\alpha\) und \(\beta\) ausgedrückt und beschreibt die Drehung um die y-Achse bzw. x-Achse (dargestellt in Abb. 3E).

Um die resultierenden Servowinkel aus den Winkeln der Glasplatte zu erhalten, muss zunächst die Höhe der Hebel an den Positionen \({g}_{i}\) (wobei \(i\) der Index des Motors ist) bestimmt werden. Daher wird die untere Glasplatte des Prismas als eine Ebene behandelt, die durch die Gleichung beschrieben werden kann

Die Position \(\left(x, y, z\right)\) beschreibt die Koordinate eines Punktes der Ebene, der im Mittelpunkt des Koordinatensystems fixiert ist, also \(\left(0, 0, 0) hat \right)\) als Flugzeugbasis. Die Werte \(a\), \(b\) und \(c\) müssen aus den Rotationswinkeln der Ebene \(\alpha\) und \(\beta\) abgeleitet werden, die als zwei Winkel betrachtet werden ein Quader mit der Diagonale \(\left|v\right|=1\).

Nach den Kosinus- und Sinusgesetzen sowie dem Satz des Pythagoras gelten drei Formeln, sodass die Werte für \(a\), \(b\) und \(c\) berechnet werden können. Sie sind:

Einfügen von Gleichungen. (3) und (4) in (2) gleich

Die Motoren verändern den Neigungswinkel der Glasplatte des Prismas (\(\alpha\) und \(\beta\)), indem sie an den mit \({g}_{ 1}\), \({g}_{2}\) bzw. \({g}_{3}\). Der Abstand zwischen der Prismenmitte und den mit \(r\) bezeichneten Angriffspunkten beträgt 23 mm. Die Positionen der Servolager bezüglich der Höhe des Hebels \({h}_{i}\) (siehe Abb. 3D) werden wie folgt beschrieben:

Durch Einsetzen in die Ebene Gl. (1) kann die lineare Verschiebung wie folgt berechnet werden:

Die Drehung der Servomotoren \({\delta }_{i}\) wird unter Verwendung der bekannten Servohebellänge \(p\) in eine vertikale Hebelverschiebung \({h}_{i}\) umgewandelt (siehe Servolager schematisch dargestellt Abb. 3D). Der Servowinkel \({\delta }_{i}\) kann mithilfe der Trigonometrie berechnet werden:

Um die Komponenten in den Strahlengang des Mikroskops zu integrieren, wurde ein kompakter Adapter entwickelt, der in Abb. 4 dargestellt ist. Es besteht aus einem LCD, einer Kondensorlinse, einem adaptiven Prisma und mehreren Controllern. Geschützt wird es durch ein 3D-gedrucktes Gehäuse. Notwendige Treiber und Controller sind bereits im Adapter integriert.

Adapter für optische Komponenten. (1) Mikroskophalterung (2) LCD-Halter (3) LCD-Treiber (4) Kondensorlinsenhalterung (5) Motortreiber (6) Adaptierbares Prisma (7) Gehäuse. Das Licht tritt von der Mikroskophalterung in den Adapter ein und verlässt ihn nach dem adaptierbaren Prisma.

Der Adapter ist für die Montage anstelle einer Kondensoreinheit in handelsüblichen Mikroskopen vorgesehen. Sein kompaktes Design lässt viel Platz zwischen ihm und dem Mikroskoptisch und erleichtert so die einfache Platzierung von MTPs.

Der Bildaufnahmeprozess eines gesamten Bohrlochs wurde vollständig automatisiert und ist in Abb. 5 schematisch dargestellt. Zu Beginn wird eine Initialisierung durchgeführt. Während dieses Vorgangs bewegt sich der Mikroskoptisch in die Mitte der Vertiefung und auf dem LCD wird ein Kreuz angezeigt. Anschließend wird von der Sekundärkamera ein Bild aufgenommen und da keine Brechung das Licht in der Mitte des Schachts stören darf, soll das Kreuz unverzerrt in der Mitte des Kamerabildes erscheinen. Die genaue Position des Kreuzmittelpunkts wird für alle folgenden Bilder als Offset \(o\) gespeichert. Als Form wird ein Kreuz verwendet, da sich dessen Mittelpunkt genauer bestimmen lässt als der Ring, der später verwendet wird.

Flussdiagramm des Bildaufnahmeprozesses. Der Prozess kann in drei Teile unterteilt werden: Initialisierung, Erfassung und Zusammenfügen. Initialisierung und Stitching werden nur einmal durchgeführt, jeweils am Anfang und am Ende des Prozesses. Der Aufnahmevorgang wird für jedes Bild wiederholt.

Nach der Initialisierung werden die Bilder einzeln aufgenommen. Zunächst wird das Prisma vertikal auf Nullneigung eingestellt. Nach dem Bewegen des Mikroskoptisches in die nächste Position wird erneut ein Kreuz auf dem LCD angezeigt und die Position \(l\) des Kreuzes wird wie bei der Initialisierung bestimmt.

Die Verschiebung \(d\) wird dann berechnet, indem der Versatz \(o\) vom Ort \(l\) subtrahiert wird. Sie kann in die Verschiebungen \({d}_{x}\) in x-Richtung und \({d}_{y}\) in y-Richtung zerlegt werden. Empirische Untersuchungen haben gezeigt, dass ein linearer Zusammenhang zwischen den Prismenwinkeln \(\alpha ({d}_{x})\) und \(\beta ({d}_{y})\) und der Verschiebung \(d\) besteht für alle Winkel, die der Aktuator erreichen kann. Daher werden die Prismenwinkel durch die Formeln definiert

wobei \({c}_{1}\) und \({c}_{2}\) empirisch ermittelt werden. Die resultierenden Servomotorwinkel \({\delta }_{i}(\alpha ,\beta )\) werden mit den Gleichungen berechnet. (1) bis (12).

Das Prisma wird dann entsprechend geneigt. Wenn die berechneten Winkel nicht erreichbar sind (für \(\alpha, \beta >20^\circ\)), bewegen sich die Servos in eine neutrale Position und der Phasenkontrast wird nicht erreicht.

Danach zeigt das LCD einen Kondensorring mit einer Verschiebung, die den Prismenwinkeln entspricht. Die Verschiebung wurde ebenfalls empirisch ermittelt, um sie an die Prismendrehung anzupassen.

Nachdem die optimalen Parameter eingestellt wurden, wird das Bild aufgenommen. Anschließend wird das Prisma auf Nullneigung zurückgesetzt, der Tisch bewegt sich in die nächste Position und der Vorgang wird dann wiederholt. Nach der Aufnahme des letzten Bildes werden alle Bilder zu einem Gesamtbild zusammengefügt.

Um die Wirksamkeit der neuen Technologie zu validieren, wurden Experimente mit dem neuen Aufbau durchgeführt und mit Ergebnissen verglichen, die mit der regulären Phasenkontrastmikroskopie erzielt wurden. Alle Messungen wurden mit demselben Mikroskop durchgeführt, wobei die adaptiven Komponenten während der Referenzmessungen deaktiviert waren.

Die Experimente wurden mit 6-, 12-, 24- und 96-Well-Platten durchgeführt. Für jeden Messsatz wurde das gleiche zellbesetzte MTP verwendet. Eine Fokusebene wurde vor der ersten Aufnahme manuell bestimmt und dann während des gesamten Prozesses statisch gehalten. Die Proben wurden zunächst mit Standard-Phasenkontrast und anschließend mit adaptiven Komponenten abgebildet. Für beide Bildsätze wurden jeweils Beispielbilder und Bertrand-Linsenbilder gespeichert und anschließend ausgewertet.

Nach der Aufnahme wurde für jedes Bild der beobachtbare Bereich bestimmt. Es wurde davon ausgegangen, dass Phasenkontrastbedingungen vorliegen, bei denen der Hintergrund dunkler ist als am Bildrand und die Zellen von einem „Heiligenschein“ umgeben sind, wie von Otaki23 vorgeschlagen. Das Phasenkontrastverhältnis wurde berechnet, indem die Phasenkontrastfläche durch die Fläche der gesamten Vertiefung geteilt wurde.

Der Unterschied in der Phasenkontrastfläche zwischen den beiden Methoden ist für ein 24-Well-MTP in Abb. 6 dargestellt. Die Bilder A.2 und B.2 zeigen die gleiche Stelle innerhalb des Wells mit unterschiedlichen Methoden. Dies zeigt deutlich, dass der Phasenkontrastumfang durch das adaptive Verfahren zum Rand hin weiter vergrößert wird. Dies wird auch durch die Überlagerung der Phasenringe in Abb. 6A.3 und B.3 bestätigt.

Vergleich von Standard- (A.1–A.3) und adaptiven (B.1–B.3) Phasenkontrastmikroskopbildern einer Vertiefung in einem 24-Well-MTP, 10-fache Vergrößerung. (A.1/B.1) Zusammengefügte Bilder des gesamten Brunnens. Phasenkontrastbedingungen liegen in Bereichen mit dunklem Hintergrund vor. Zur Verdeutlichung sind sie orange umrandet. Die mit einem grünen Kästchen hervorgehobenen Bilder werden jeweils in (A.2/B.2) angezeigt. (A.2) Es sind keine Phasenkontrastbedingungen festgelegt. (A.3) Der Phasenring und der Kondensorring stimmen nicht mit der Bildposition in (A.2) überein. (B.2) Phasenkontrastbedingungen gelten für das gesamte Bild. (B.3) Der Phasenring und der Kondensatorring richten sich an der Position des Bildes in (B.2) aus.

Darüber hinaus gibt es beim adaptiven Ansatz eine scharfe Grenze zwischen Phasenkontrast- und Nichtphasenkontrastbedingungen. Dies wird durch den Korrekturmechanismus verursacht, der stoppt, sobald der Flüssigkeitswinkel nicht mehr korrigierbar ist, sodass entweder Phasenkontrastbedingungen hergestellt werden oder diese vollständig fehlen.

Ein weiterer Indikator für die Phasenkontrastbedingungen, die in einem Bild erfüllt sind, ist die Überlagerung von Kondensatorring und Phasenring. Abbildung 7A.1, B.1 vergleicht die Überlagerung in jedem einzelnen Bild und das resultierende Phasenkontrastbild für eine 96-Well-Platte. Die entsprechenden Phasenkontrastbilder mit hervorgehobenem beobachtbaren Bereich sind in Abb. 7A.2, B.2 dargestellt. Die Überlagerungsbilder zeigen, dass der Unterschied in der Phasenringüberlappung hauptsächlich in der Nähe der Bohrlochperipherie vorherrscht, was auch im Phasenkontrastbild sichtbar ist.

Vergleich der Phasenkontrastbilder in einem Well eines 96-Well-MTP, 10-fache Vergrößerung. (A) Standard-Phasenkontrast. (B) Adaptiver Phasenkontrast. (A.1/B.1) Kondensorring- und Phasenringausrichtung (A.2/B.2) Phasenkontrastbilder. Phasenkontrastbereiche sind orange umrandet.

Ähnlich wie bei den zuvor beschriebenen Experimenten wurde das Verfahren für andere Wellplatten wiederholt. Tabelle 1 fasst die experimentellen Ergebnisse für alle untersuchten Bohrlochgrößen zusammen.

Die Aufnahmezeit für ein Bild beträgt ca. 5 s. Die Gesamtprozesszeit hängt von der Anzahl der Aufnahmen ab, die zum Abbilden eines gesamten Bohrlochs erforderlich sind, und ist in Tabelle 1 aufgeführt.

Wie in Tabelle 1 gezeigt, ist die relative Zunahme der beobachtbaren Fläche für alle untersuchten Bohrlochgrößen signifikant. Sie reicht von fast dem Doppelten bei 6-Well-Platten bis zu mehr als dem 12-fachen bei 96-Well-MTPs. Die Vergrößerung der beobachtbaren Fläche ist bei kleineren Bohrlochgrößen am größten, da die relative Fläche, die mit Phasenkontrast abgebildet werden kann, mit dem Bohrlochdurchmesser abnimmt. Die kleinsten Vertiefungen in den Experimenten waren die von 96-Well-Platten. Es ist nicht klar, ob sich der Trend bei noch kleineren Wells fortsetzt, da die beobachtbare Fläche der Wells von 96-Well-Platten bereits nur 2,3 % beträgt und möglicherweise nicht weiter signifikant abnimmt. Darüber hinaus verwenden kleinere Formate wie 384-Well-Platten normalerweise rechteckige Wells anstelle der runden, die bei größeren Formaten zu finden sind. Aufgrund des Anpassungsansatzes wird jedoch davon ausgegangen, dass die Phasenkontrastbedingungen auch für nicht kreisförmige Vertiefungen verbessert werden können.

Wie im Abschnitt „Konkurrierende Ansätze“ dargestellt, gibt es bereits eine Vielzahl von Ansätzen zur Meniskuskompensation. Die meisten von ihnen sind jedoch darauf ausgelegt, mit einem bestimmten Zellkulturmedium unter vordefinierten Bedingungen zu arbeiten. Daher sind sie unter sich ändernden Umständen oder mit unterschiedlichen Medien nicht robust. Darüber hinaus sind spezielle Mikrotiterplatten, Deckel oder Einsätze erforderlich, die deutlich teurer sind als Standard-Mikrotiterplatten. Mikrotiterplatten werden in der Regel in großen Mengen verwendet und sind als Einwegprodukte konzipiert, sodass die Verwendung kostengünstiger Standardprodukte von Vorteil ist.

Die adaptive Phasenkontrastmikroskopie bietet einen flexiblen Ansatz zur Kompensation des Meniskuseffekts, der zudem mit herkömmlicher Laborhardware funktioniert. Die Technologie weist gegenüber konkurrierenden Ansätzen mehrere Vorteile auf, wie experimentelle Ergebnisse belegen. Insbesondere ermöglicht es eine deutliche Vergrößerung des beobachtbaren Bereichs im Phasenkontrast. Aufgrund seiner Anpassungsfähigkeit und Flexibilität kann es mit verschiedenen Flüssigkeiten mit unterschiedlichen Brechungsindizes verwendet werden. Es erfordert nicht einmal MTPs, ist aber für alle mit Flüssigkeit gefüllten Gefäße anwendbar, die auf inverse Mikroskope passen. Da der Phasenkontrastadapter einfach in ein normales Inversmikroskop eingebaut werden kann, stehen die meisten Standardfunktionen weiterhin zur Verfügung und bieten gleichzeitig einen größeren beobachtbaren Bereich bei der Phasenkontrastmikroskopie. Darüber hinaus bietet dieser Ansatz auch eine praktikable nicht-invasive Alternative zur Fluoreszenzmikroskopie.

Diese Vorteile gelten auch für den Ansatz von Douglas, der nur den digitalen Kondensatorring nutzt18. Dies allein reicht jedoch nicht aus, um die Brechung in Randnähe zu kompensieren, insbesondere wenn der Flüssigkeitsoberflächenwinkel steil ist. Es kann nur die seitliche Verschiebung \(\Delta\) der Lichtstrahlen kompensieren, nicht jedoch die Winkeldrehung \(\varphi\).

Alle Bilder einer Bildserie wurden immer in der gleichen Fokusebene aufgenommen. Um die Schärfe zu verbessern, sollten zukünftige Arbeiten, die auf dieser Technologie aufbauen, einen Fokuskorrekturmechanismus enthalten. Dennoch reichte das aktuelle Setup aus, um wie oben dargestellt ausdrucksstarke Bilder zu erstellen.

Ein Nachteil des vorgestellten Ansatzes ist die langsame Bildaufnahme. Da immer mehr Labore automatisiert werden und einen höheren Durchsatz erfordern, ist ein schneller Erfassungsprozess erforderlich24. Ein Ansatz zur Beschleunigung des adaptiven Phasenkontrastprozesses wäre die Aufnahme von Bildern während der Probenbewegung, was bereits für die reguläre Phasenkontrastmikroskopie gezeigt wurde25. Es ist geplant, diesen Ansatz in einem zukünftigen Forschungsprojekt zu bewerten.

Durch die adaptive Phasenkontrastmikroskopie ist es möglich, den Einsatzbereich der Phasenkontrastmikroskopie deutlich zu erweitern. Quantifizierbare Studien wurden mit Mikrotiterplatten durchgeführt. Der beobachtbare Bereich wurde gemessen und mit der herkömmlichen Phasenkontrastmikroskopie verglichen. In allen Fällen zeigte sich eine signifikante Vergrößerung der beobachtbaren Fläche, mit einem größeren Effekt bei kleineren Bohrlöchern aufgrund eines ausgeprägteren Meniskuseffekts. Bei 96-Well-Platten vergrößert sich die nutzbare Fläche um mehr als das Zwölffache, von etwa 2,3 % der gesamten Wellfläche auf etwa 28 %, wodurch die Phasenkontrastmikroskopie eine praktikable Option für das nicht-invasive Scannen von Zellkulturen wird.

Darüber hinaus ist die Lösung vollständig automatisierbar, sodass eine Integration in einen automatischen Prozess möglich ist. Im Gegensatz zu anderen Methoden zur Kompensation des Meniskuseffekts ist keine spezielle Laborhardware erforderlich, sondern es können Standard-Mikrotiterplatten verwendet werden.

Aus diesen Gründen hat der vorgestellte Ansatz das Potenzial, den Anwendungsbereich der Phasenkontrastmikroskopie erheblich zu erweitern, insbesondere wenn die Bildgebungszeit reduziert werden kann.

Die Autoren bestätigen, dass die Bilddaten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, im Artikel verfügbar sind. Der Versuchsaufbau wurde am Fraunhofer IPT aufgebaut und ist im Artikel beschrieben. Die Steuerungssoftware ist geistiges Eigentum der Fraunhofer-Gesellschaft und daher nicht zur Veröffentlichung berechtigt.

Die ursprüngliche Online-Version dieses Artikels wurde überarbeitet: In der Originalversion dieses Artikels war die E-Mail-Adresse für Florian Nienhaus falsch. Die korrekte E-Mail-Adresse von Florian Nienhaus lautet [email protected].

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Open-Access-Förderung ermöglicht und organisiert durch Projekt DEAL. Das IGF-Projekt „APERITIf“ Nr. 19083 N der Forschungsvereinigung Feinmechanik, Optik und Medizintechnik e. V. (FOM) wurde vom Bundesministerium für Wirtschaft im Rahmen des Programms gefördert die Förderung der industriellen Gemeinschaftsforschung (IGF) der AiF aufgrund eines Beschlusses des Deutschen Bundestages.

Fraunhofer-Institut für Produktionstechnologie IPT, Aachen, Deutschland

Florian Nienhaus, Tobias Piotrowski, Bastian Nießing, Niels König & Robert H. Schmitt

WZL | RWTH Aachen University, Aachen, Germany

Robert H. Schmitt

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FN verpflichtete sich zu allen Teilen der Studie und Arbeit. TP hat die Studie entworfen und sich an allen Teilen der Arbeit beteiligt. BN, NK und RS überwachten und ergänzten die Bedeutung der Zellkultivierung und Automatisierung. Alle Autoren haben das Papier überprüft und überarbeitet.

Korrespondenz mit Florian Nienhaus.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Nienhaus, F., Piotrowski, T., Nießing, B. et al. Adaptive Phasenkontrastmikroskopie zur Kompensation des Meniskuseffekts. Sci Rep 13, 5785 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-32917-6

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Eingegangen: 08. Dezember 2022

Angenommen: 04. April 2023

Veröffentlicht: 08. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-32917-6

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