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Jun 28, 2023

Vergleich alternativer Technologien zur Reinigung viraler Vektoren

Von Jack Vicalvi, leitender Wissenschaftler, J2 Biopharm Associates LLC Dies ist ein Überblick über ausgewählte innovative Produkte und Ansätze, die in den letzten 15 Jahren entwickelt wurden und dazu beigetragen haben

Von Jack Vicalvi, leitender Wissenschaftler, J2 Biopharm Associates LLC

Dies ist ein Überblick über ausgewählte innovative Produkte und Ansätze, die in den letzten 15 Jahren entwickelt wurden und zu Verbesserungen beigetragen haben, die die Herstellung viraler Vektortherapeutika mit höheren Wiederfindungsraten und Reinheiten ermöglichen.

Dies ist der zweite Teil einer Serie, die sich mit einigen spezifischen Fortschritten in der Reinigungstechnologie befasst. Im ersten Teil wurden nachgelagerte Geräte und Prozesse für monoklonale Antikörper besprochen.

Im zweiten Teil untersuchen wir, wie diese Produkte die Art und Weise verändern können, wie wir solche viralen Vektortherapeutika herstellen, wo sie in aktuellen Prozessentwicklungsprogrammen eingesetzt werden können und welche Vorteile sie gegenüber früheren Methoden bieten. Wir gehen auf die Situationsökonomie ein, die den Einsatz dieser innovativen Produkte oder Ansätze vorantreibt. Schließlich konzentrieren wir uns aus praktischen Gründen auf GMP-Scale-up-Modelle: Wenn es nicht nach GMP skaliert werden kann, spielt es keine Rolle, wie gut es in der Entwicklung funktioniert.

Flussdiagramme für virale Vektorprozesse

Die Klärung viraler Vektorernten ist komplizierter als die Klärung von mAb. Die traditionelle Klärung beginnt normalerweise mit einer Differential- oder Gradientenzentrifugation. Dies kann bestenfalls für die GMP-Herstellung in Maßstäben über 100 l problematisch sein, da die Chargengröße des Zentrifugenbehälters im Allgemeinen klein ist (10 bis 20 l); Hinzu kommen Bedenken hinsichtlich der Aerosolerzeugung, Reinigung und Validierung sowie die Investitionskosten für die Ausrüstung, die möglicherweise ausschlaggebend sind. Auch bei einem Zentrifugationsschritt bleiben Tiefenfiltration und Sterilfiltration notwendig. Die Verwendung geladener Tiefenfilter kann je nach Virus unhaltbar sein, da die meisten Viren durch anionische Ladungseinheiten gebunden werden. Allerdings werden in Gegenwart von 200 bis 300 mM NaCl viele Viren durch solche Geräte nicht entfernt, während ein Teil der HCP- und Wirtszell-DNA immer noch gebunden ist.

Behüllte Viren wie Lentiviren und Alphaviren sind labiler und kommen bei der Tiefenfiltration möglicherweise nicht gut zurecht. Allerdings sind die Alphaviren robuster und eignen sich möglicherweise für die normale und sogar aufgeladene Tiefenfiltration. In diesen Fällen verwenden wir Pall SupraCap 100 (4 bis 2,1 µm), Pall HCDII (1,2 µm) und AcroPak 500 (0,8 bis 0,45 µm) in Reihe. Es können auch die Millipore DOHC-, COHC- und XOHC-Membranen verwendet werden. Der Einsatz von 0,2-µm-Filtern führt in der Regel zu erheblichen Verlusten und sollte bis zur Endfiltration vermieden werden. Die Aufrechterhaltung eines aseptischen geschlossenen Systems während der Verarbeitung ist unerlässlich.

Die bekannteren unbehüllten Viren wie Adenoviren (AV) und Adeno-assoziierte Viren (AAV) können mit den geladenen 3M-Tiefenfiltern in Gegenwart von 180 bis 250 mM NaCl abgeklärt werden. Wir verwenden die Filter 05SP (10 bis 2 µm) und 60SP (3 bis 0,2 µm) in Reihe für unbehüllte und einige umhüllte Alphaviren.

Die traditionelle Methode zur Erfassung viraler Vektoren ist AIEX. Dies kann mithilfe von Harzen oder Membranen erfolgen. Bei umhüllten Viren ist der Membranansatz in der Regel am besten geeignet, da er für das Virus viel schonender ist als der mühsame Weg durch eine gepackte Säule. Zu den am häufigsten verwendeten Geräten gehören der Pall Mustang Q, der Sartorius Sartobind Q-STIC und der BIA CIMultus Monolith. Der größte Nachteil von Membranen oder Monolithen ist ihre geringe Kapazität, was dazu führt, dass mehrere Zyklen verwendet werden müssen. Allerdings kann auch die Verwendung einer Säule mit einer kurzen Betthöhe (6 bis 10 cm) funktionieren, mit dem zusätzlichen Vorteil einer deutlich höheren Kapazität gegenüber Membranen. Häufig verwendete unbehüllte Viren können entweder durch Harz- oder Membrangeräte eingefangen werden.

Eine alternative Methode ist die Affinitätschromatographie. Viele Viren haben Heparin-Bindungsstellen auf ihrer Oberfläche, darunter auch behüllte Viren. Wir hatten Erfolg mit Heparin HyperD als Einfangschritt für ein Alphavirus nach dem M-SAN-Nukleaseverdau und der Klärung, was zu einer Rückgewinnung von >90 % mit ausgezeichneter Entfernung von hcDNA und einer signifikanten Reduzierung von HCP führte, während die Säule mit 450 cm/h betrieben wurde. Die HyperD-Keramikharze ähneln in ihrer Funktionsweise den Polystyrolharzen. Es gibt andere Reinigungsprotokolle, die Cellufinsulfat oder Capto DeVirS als ersten Einfangschritt verwenden; Diese Harze haben sich bei der Reinigung von Flaviviren gut bewährt.

Tabelle 1.Viral Vector Capture-Vergleich (AIEX) von weichen vs. starren Harzen vs. Membranen

*Q Sepharose bei 6.000 $/L = 60.000 $/Säule x 2 (GMP-Backup) = 120.000 $ + Säulen (je 40.000–60.000 $).**POROS HQ bei 7.500 $/L = 75.000 $/Säule x 2 (GMP-Backup) = 150.000 $ + Spalten (jeweils 40.000–60.000 US-Dollar).***Mustang Q XT @ 18.000 US-Dollar pro Stück x 2 (GMP-Backup) = 36.000 US-Dollar.

Bei vielen herkömmlichen Ansätzen für unbehüllte Viren gibt es möglicherweise keine Polierschritte. Es könnte jedoch ratsam sein, etwas vorzusehen, um einen Teil des verbleibenden HCP zu entfernen. Zu den Optionen können CIEX, HIC, SEC oder gemischte Modalitäten gehören. Abhängig von der Porengröße des ausgewählten Harzes kann gemischtes Modal alle drei enthalten. Wenn CIEX ausgewählt wird, beachten Sie, dass ein pH-Wert in der Nähe oder unter dem PI des Virus das Virus inaktivieren kann. Sie werden viele Viren wiederherstellen, aber sie werden nicht infektiös sein. Capto Core 700 verfügt über eine anionische Einheit an einem langen hydrophoben Arm, der an Agarose mit Porengrößen befestigt ist, die eine Virusdiffusion verhindern. In Gegenwart von Salz (z. B. aus einem Capture-Elution-Schritt) wird das Virus nicht an AIEX gebunden; hcDNA wird jedoch gebunden und HCP wird durch die hydrophobe Einheit gebunden. Capto MMC verfügt über eine kationische Einheit an einem langen hydrophoben Arm, der an vernetzter Agarose befestigt ist und in einem Durchflussverfahren verwendet werden kann.

Im Gegensatz dazu verhalten sich umhüllte Viren mit HIC-basierten Harzen nicht gut; Ihre Membranen sind sehr hydrophob und lösen sich unter normalen Betriebsbedingungen nicht leicht. Die meisten umhüllten Viren neigen auch dazu, unter normalen Betriebsbedingungen an viele CIEX-Harze zu binden. Ein alternativer Ansatz besteht darin, ein AIEX-Harz oder eine AIEX-Membran nach der Affinitätseinfangung als primären Polierschritt zu verwenden.

Der SEC-Ansatz ist eine weitere Alternative, die es dem Virus ermöglicht, das Ausschlussvolumen zu passieren und gleichzeitig HCP und kleinere kontaminierende Fragmente in der Matrix einzufangen. BioWorks verfügt über ein SEC-Harz, das bei hoher Kapazität (20 % des Harzvolumens) und einer für solche Harze angemessenen Geschwindigkeit (120 bis 180 cm/h) gut funktioniert, während die meisten SEC-Harze bei einer Beladung von 3 % bis 10 % des Harzes am besten funktionieren Volumen und einer linearen Geschwindigkeit von 20 bis 60 cm/h.

Sowohl bei herkömmlichen als auch bei alternativen Methoden wird dieser Schritt im Allgemeinen weggelassen. Wenn jedoch die HCP-Werte oder das Verhältnis von leerem zu vollem Kapsid nach den Schritten zum Einfangen und Mischmodalpolieren immer noch höher als gewünscht sind, kann ein zusätzlicher Polierschritt mit einem SEC-Harz wie oben beschrieben angebracht sein. Alternativ kann in diesem Schritt eine kürzlich entwickelte skalierbare automatische Rotations-Ultrazentrifuge von Alfa Wasserman zur Entfernung von Wirtszellverunreinigungen sowie leeren oder teilweise gefüllten Kapsiden nützlich sein.

Viele Methoden versuchen, den TFF-Schritt als Mittel zur Reduzierung von HCP und hcDNA zu nutzen. Im Allgemeinen funktioniert dies selten, da diese Verunreinigungen, sofern sie noch vorhanden sind, wahrscheinlich durch ionische oder hydrophobe Wechselwirkungen mit dem Zielmolekül verbunden sind. Darüber hinaus verfügen dichte Membranen von 10 bis 30 kD einfach nicht über Porengrößen, die groß genug sind, um die meisten HCPs (30 bis 60 kD) passieren zu lassen. Obwohl die meisten Viren viel größer als 300 kD sind, sind sie formbar und können unter normalen Betriebsbedingungen (10 bis 15 psi) durch diese Membranen dringen. In den meisten Fällen funktionieren die 100-kD-Membranen am besten, obwohl AAVs für eine maximale Rückgewinnung möglicherweise eine 50- bis 70-kD-Membran erfordern.

Der Hauptunterschied zwischen der mAb-Reinigung und der Virusreinigung ist die Virusclearance. Die zur Virusentfernung in mAb-Prozessen verwendeten Methoden (außer der Filtration) sind die Methoden, die zur Virusreinigung verwendet werden. Die Prinzipien der Chromatographie bleiben die gleichen: Sie nutzen Unterschiede in der Ladung (aufgrund des pH-Werts und der Leitfähigkeit), des Molekulargewichts, der Hydrophobie und möglicherweise der Ligandenaffinität.

Auch die Klärung ist ähnlich, da die Ernte wie bei der mAb-Produktion mit proteolytischen Enzymen und Zelltrümmern beladen ist und diese Verunreinigungen so früh wie möglich entfernt werden müssen. Wichtig ist, dass Sie den Prozess mit Ihrer besten Chance beginnen, nicht nur Ihr Zielmolekül einzufangen, sondern auch so viele Verunreinigungen wie möglich zu entfernen.

Die Auswahl von Säulen, Harzen und Membranen für die Reinigung viraler Vektoren wirft die gleichen Bedenken auf wie bei der mAb-Reinigung. Repligen bietet vorgepackte Opus-Einwegsäulen von 50 µL bis 150 L (80 cm Durchmesser) an. Sie können mit mehr als 300 benutzerdefinierten Harzen in verschiedenen Betthöhen von 0,25 bis 30 cm gefüllt werden. Alternativ arbeiten Sepragen Radial Flow Superflo-Säulen vier- bis zehnmal schneller bei einem niedrigeren Betriebsdruck und geringeren Poolvolumina als herkömmliche Axialsäulen, was eine erhebliche Reduzierung der Reinigungskosten ermöglicht. Diese Säulen sind auch in einem vorgepackten Format mit jedem beliebigen Harz erhältlich. Das Interessante an Radialströmungssäulen ist, dass die Betthöhe normalerweise 5 bis 7 cm beträgt und die Vergrößerung durch eine Vergrößerung der Rohrlänge erreicht wird, ähnlich einem Hohlfaseransatz. Diese Anordnung könnte für die Reinigung labiler umhüllter Viren vorteilhafter sein.

Starre Harze können mit hohen linearen Geschwindigkeiten (800 bis 1.200 cm/h) ohne nennenswerten Produktivitätsverlust betrieben werden. Alternativ vermarktet Pall Danaher eine faserbasierte Chromatographieplattform, die durch die Übernahme von Puridify (von Cytiva) erworben wurde. Das Faserformat verfügt über eine offene Porenstruktur, die einen konvektiven Massentransport ermöglicht, was zu von der Durchflussrate unabhängigen Bindungskapazitäten und Zykluszeiten von Minuten im Vergleich zu Stunden bei der herkömmlichen Harzchromatographie führt. Diese Membranen und Fasern können vor der Entsorgung für den schnellen Kreislauf einer einzelnen Charge verwendet werden, und die größeren Oberflächen und mikroporösen Strukturen könnten diese Fasertechnologien auch für die Reinigung viraler Vektoren geeignet machen.

Bei unbehüllten Viren ist das Einfangen durch AIEX-Harz der beliebteste Ansatz. Ein Affinitätsharz ermöglicht jedoch eine stärkere Reduzierung von HCP und hcDNA im Durchfluss, während AIEX HCP und hcDNA bindet. Für AIEX können selektive Pufferwaschungen verwendet werden, um etwas HCP zu reduzieren und leere Kapside vor der Elution zu entfernen; hcDNA bindet tendenziell fester als die meisten HCPs und erfordert zur Entfernung aus dem Harz stärkere Salz- und/oder NaOH-Waschvorgänge. Wie bereits erwähnt, trägt die Wahl der Matrixzusammensetzung auch zur Entfernung oder Zurückhaltung von Verunreinigungen bei und kann die Notwendigkeit einer weiteren Reinigung nach jedem Schritt entweder beseitigen oder erhöhen.

Wie bei mAbs sollte die Reihenfolge nach dem Einfangschritt für virale Vektoren durch die Elutionsbedingungen aus dem vorherigen Schritt bestimmt werden. Durch die Reduzierung der Puffermanipulation zwischen den Schritten werden unnötige TFF-Schritte vermieden. Einige einfache Pufferverdünnungen können erforderlich sein, um die Leitfähigkeit oder den pH-Wert des vorherigen Elutionsschritts zu ändern, und sollten nach Möglichkeit in Mischtanks gehandhabt werden, insbesondere bei Bindungs-Elutionsschritten. Durchflussschritte sind normalerweise dem letzten Schritt vor der TFF vorbehalten, da sie dazu neigen, das Volumen der Arzneimittelsubstanz zu erhöhen. Die Verwendung von Membranen anstelle von Harzen in Durchflussschritten trägt dazu bei, die resultierende Volumenzunahme zu reduzieren und den TFF-Konzentrationsschritt zu verkürzen.

Die Wahl des geeigneten molekularen Cutoffs für die TFF-Membran ist von entscheidender Bedeutung. Virale Vektoren sind in ihrer Größe variabler als mAbs; Sie sind jedoch immer viel größer als mAbs und können auch unter Druck ihre Form ändern und sich durch Poren mit mehr als 100 kD drücken. Wir haben umhüllte Alphavirus-Partikel (90 bis 100 nm) im Diafiltrat von 300-kD-Membranen unter normalen Betriebsbedingungen (10 bis 15 psi) gefunden, jedoch nicht im Diafiltrat von 100-kD-Membranen. Kleinere Viren wie AAV erfordern engere Porengrößen (30 bis 70 kD), was eine frühere Entfernung von HCP im Prozess zwingender macht.

Schließlich sind Kosten und Produktivität die wichtigsten Treiber jeder Reinigungsstrategie. Berücksichtigen Sie beim Entwurf Ihrer Methode stets die Herstellungskosten. Relativ geringe Kostensteigerungen während der Prozessentwicklung können bei kluger Wahl zu höherer Produktivität und Kosteneinsparungen während der Fertigung führen. Berücksichtigen Sie bei der Auswahl eines bestimmten Schritts (Harz oder Membran) immer die GMP-Herstellungskosten (Validierung, Suite-Zeit, Pufferverbrauch usw.). Lassen Sie außerdem Ihre kritischen Qualitätsmerkmale die Prozessentwicklung vorantreiben; Wenn Sie sich frühzeitig für den einfachsten oder kostengünstigsten Weg entscheiden, kann es sein, dass Sie in der Fertigung ein Problem werden.

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Über den Autor

Jack Vicalvi ist leitender Wissenschaftler und Leiter der Downstream-Prozessentwicklung bei J2 Biopharm Associates, einem Beratungsunternehmen, wo er biopharmazeutische Unternehmen zu GMP-Herstellungsprozessen berät und Unterstützung bei Zulassungsanträgen bietet. Zuvor arbeitete er für Pall Life Sciences als leitender Wissenschaftler und Manager für nachgelagerte Prozessentwicklung. Zuvor hatte er unter anderem Führungs- und Forschungspositionen bei Goodwin Biotechnology, Xcellerex, Exact Labs, Catalent und Sunovion Pharmaceuticals inne. Sein Grundstudium absolvierte er am St. Anselm College, gefolgt von Graduiertenprogrammen in Immunologie an der Southern Illinois University und Parasitologie an der Vanderbilt. Vernetzen Sie sich mit ihm auf LinkedIn.

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