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May 03, 2024

Transmissionsstrukturierte Beleuchtungsmikroskopie mit abstimmbarer Frequenzbeleuchtung unter Verwendung einer Kippspiegelbaugruppe

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 1453 (2023) Diesen Artikel zitieren 1976 Zugriff auf 4 altmetrische Metrikdetails Wir präsentieren experimentelle Demonstration der kippspiegelunterstützten Übertragung

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 1453 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Wir präsentieren eine experimentelle Demonstration der kippspiegelunterstützten Transmissionsstrukturbeleuchtungsmikroskopie (tSIM), die eine hochauflösende Bildgebung mit großem Sichtfeld bietet. Als Beleuchtungsmodul wird eine Anordnung speziell entwickelter Kippspiegel verwendet, bei der die Probe durch die Interferenz zweier Strahlen angeregt wird, die vom gegenüberliegenden Spiegelfacettenpaar reflektiert werden. Durch Änderung des Spiegelneigungswinkels werden abstimmbare frequenzstrukturierte Muster erzeugt und die hexagonalsymmetrische Anordnung wird für die isotrope Auflösung in drei Orientierungen berücksichtigt. Die Verwendung eines Objektivs mit hoher numerischer Apertur (NA) in Standard-SIM ermöglicht eine Superauflösung bei gleichzeitiger Beeinträchtigung des Sichtfelds (FOV). Unter Verwendung einer Objektiverkennung mit niedriger NA (20X/0,4) demonstrieren wir experimentell ein Einzel-FOV-Bild mit der Größe \(\sim\) (0,56 mm\(\times\)0,35 mm) mit \(\sim\)1,7- und \(\ sim\)2,4-fache Auflösungsverbesserung (Ausnutzung verschiedener Beleuchtungen durch Einstellen von Kippspiegeln) über die Beugungsgrenze. Die Ergebnisse werden sowohl für die fluoreszierenden Perlen als auch für biologische Proben überprüft. Die tSIM-Geometrie entkoppelt die Beleuchtungs- und Sammellichtpfade und ermöglicht so einen freien Wechsel der Abbildungsobjektivlinse, ohne die räumliche Frequenz des Beleuchtungsmusters zu beeinflussen, die durch die Kippspiegel definiert wird. Das große und skalierbare FOV, das von tSIM unterstützt wird, wird für Anwendungen eingesetzt, bei denen das Scannen großer Bereiche erforderlich ist, wie in der Pathologie und für Anwendungen, bei denen Bilder sowohl räumlich als auch zeitlich korreliert werden müssen.

Das Durchbrechen der Beugungsgrenze1,2 der klassischen Fluoreszenzmikroskopie hat in den letzten zwei Jahrzehnten die biomedizinischen Studien revolutioniert und zu einem neuen Forschungsgebiet namens „optische Nanoskopie“3,4 geführt. Im schnell voranschreitenden Bereich der Nanoskopie erscheint die strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (SIM)5,6,7 als bedeutende Weitfeld-Superauflösungstechnik, bei der eine Reihe strukturierter Muster zur Anregung der fluoreszierenden Probe verwendet werden und entsprechende rohe Moiré-Bilder rechnerisch verarbeitet werden gegenüber der Weitfeldgrenze eine etwa zweifache Auflösungsverbesserung erreichen. Obwohl es im Vergleich zu anderen optischen Superauflösungstechniken wie der stimulierten Emissionsdepletion (STED),8,9 der stochastischen optischen Rekonstruktionsmikroskopie (STORM) und der fotoaktivierten Lokalisierungsmikroskopie (PALM) eine relativ moderate Auflösungsverbesserung bietet, 12,13 oder Grundzustandsdepletion (GSD),14,15 SIM hat aufgrund seiner hohen räumlich-zeitlichen Auflösung, geringen Phototoxizität, Kompatibilität mit gängigen Fluoreszenzmarkierungen, effizienter Mehrfarbenbildgebung16,17 usw. große Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Es gilt auch als vielversprechender Ansatz für die Untersuchung der subzellulären Dynamik lebender Zellen18,19, da eine geringere Anzahl von Rohbildern und eine niedrige Photonendosis erforderlich sind. Obwohl das sinusförmige strukturierte Anregungsmuster das Schlüsselmerkmal für die Erzielung einer Bildgebung mit überlegener Auflösung durch SIM ist, ist es nicht mehr auf die periodischen Beleuchtungsmuster beschränkt. Speckle-ähnliche20,21 zufällige Beleuchtungen mit blinden Rekonstruktionsansätzen werden auch erfolgreich für die SIM-Bildgebung implementiert. Allerdings bieten die Zufallsbeleuchtungsmethoden eine Superauflösung auf Kosten einer geringen zeitlichen Auflösung, da eine große Anzahl von Bildern erforderlich ist (\(\sim\)100s). Diese Methoden löschen das Hauptthema der periodischen strukturierten Beleuchtungsbildgebung aus, die die erforderliche Anzahl von Frames 9(15) in 2D(3D)-SIM-Fällen minimiert, in bestimmten Fällen sogar noch weniger22,23, wie kürzlich berichtet wurde. Daher lohnen sich die Bemühungen, die Auflösung von SIM durch Beibehaltung wohldefinierter periodischer Beleuchtungsmuster weiter zu verbessern.

Bei der herkömmlichen linearen SIM-Technik wird eine einzige Objektivlinse zur Beleuchtung der Probe sowie zum Sammeln des Fluoreszenzsignals verwendet. Folglich sind sowohl die Beleuchtungs- als auch die Detektionsoptik durch dieselbe Objektivlinse beugungsbegrenzt, und das System ist streng darauf beschränkt, eine zweifache Auflösungsverbesserung im Vergleich zur klassischen Beugungsgrenze zu bieten. Um die typische SIM-Auflösungsgrenze noch weiter zu übertreffen, gibt es das Total Internal Reflection Fluorescent (TIRF)-SIM24,25, bei dem das hochfrequente Interferenzmuster evaneszenter Wellen die Probe beleuchtet. Allerdings ist die TIRF-Beleuchtung auf einen dünnen optischen Abschnitt (<100 nm) beschränkt und befasst sich daher nur mit der 2D-Bildgebung. Darüber hinaus werden die Sättigungseigenschaften der fluoreszierenden Materialien im nichtlinearen SIM-Ansatz26,27,28 genutzt, der die Beiträge mehrerer Harmonischer in der hochauflösenden Bildgebung berücksichtigt. Das Erfordernis einer hohen Intensität, um den Betriebssättigungsgrad der Fluorophore zu erreichen, kann jedoch zu Phototoxizitätsproblemen für den nichtlinearen Ansatz führen. Es wurde auch über weitere SIM-Techniken berichtet, die auf anderen Prinzipien basieren, z. B. plasmonisch29,30, Proximity Projection Grating31 oder photonischer Chip32. Jede dieser Techniken erfordert hochentwickelte und spezielle photonische oder plasmonische Materialien, um das strukturierte Beleuchtungsmuster in der Probenebene zu manipulieren. Darüber hinaus sind speziell entwickelte Werkzeuge für die Phasenverschiebung und Änderung der Musterorientierung erforderlich, z. B. Thermooptiken für photonische Chip-SIMs oder Galvo-Scanning für plasmonische SIMs. Im Allgemeinen sind diese Techniken aufgrund ihrer Abhängigkeit vom jeweiligen Material komplex; was die Abstimmbarkeit der Beleuchtungsmusterfrequenz einschränkt. Bei der plasmonischen SIM werden die vorkalibrierten Array-Strukturen entsprechend dem Betriebswellenlängenbereich hergestellt. Die spezifische Struktur bestimmt gezielt die Ausrichtung und die Frequenz des Beleuchtungsmusters, es gibt keine Einstellbarkeit des Musters. In ähnlicher Weise wird bei photonischen Chip-SIM die Beleuchtungsmusterfrequenz durch die Winkel der verfügbaren Wellenleiterarme vorab bestimmt. Schließlich funktionieren herkömmliche Proben auf Objektträgern oder Deckgläsern für diese Methoden nicht. Es ist erforderlich, die Probe auf der Oberfläche des entworfenen Materials vorzubereiten, die durch das Interferenzmuster stehender Wellen im evaneszenten Bereich beleuchtet wird, wodurch diese Techniken auf 2D-TIRF-Superauflösung beschränkt sind.

Im Wettlauf um die bestmögliche Auflösung werden typischerweise Objektive mit hoher numerischer Apertur für die SIM-Bildgebung verwendet. Das hochauflösende Bild im SIM mit der Objektivlinse mit hoher NA wird durch Kompromisse beim Sichtfeld (FOV) erzielt. Diese Einschränkung erscheint aufgrund des inhärenten Kompromisses zwischen der Auflösung und dem Sichtfeld des Standard-Bildgebungssystems. Aufgrund dieser Abhängigkeit befassten sich die Superauflösungstechniken der nächsten Stufe mit der Bildgebung mit großem Sichtfeld und verbesserten gleichzeitig die Auflösung33,34. Kürzlich wurde über einen theoretischen Ansatz35 berichtet, der diese Einschränkung überwinden kann, indem der Beleuchtungspfad vom Sammelpfad mithilfe einer Kippspiegelkonfiguration vom Transmissionstyp entkoppelt wird. Dennoch wurde die Technik nicht experimentell für die Bio-Bildgebungsanwendung mit skalierbarem Sichtfeld und Bildgebung mit skalierbarer Auflösung demonstriert. Hier demonstrieren wir den experimentellen Proof-of-Concept der SIM-Technik mit kippspiegelunterstützter Übertragung, die das Potenzial besitzt, die SIM-Karte mit hohem Durchsatz unter Nutzung der Freiraumoptik auf kostengünstige Weise zu nutzen. Die Befreiung der Beleuchtungsoptik von der Beugungsgrenze des Sammelobjektivs ermöglicht die volle Flexibilität, mit der Beleuchtungskonfiguration zu spielen. Dies ist unseres Wissens nach auch der erste experimentelle Beweis, der beschreibt, dass es möglich ist, die Beleuchtung für Nanoskopie mit großem Sichtfeld zu entwerfen, ohne das Licht durch eine Kondensorlinse24,36, einen Wellenleiterchip32,34 oder fortschrittliche Materialien37,38 zu leiten.

Die Entkopplung der Beleuchtung von der Detektionsoptik in der Architektur der Durchleuchtungsmikroskopie ebnet den Weg zur Erforschung der vielseitigen Beleuchtungsmodalitäten. In dieser Arbeit präsentieren wir eine experimentelle Demonstration des Prinzips der Durchleuchtungs-SIM-Technik, bei der eine Anordnung von Mini-Kippspiegeln als Beleuchtungsmodul fungiert. Da der Anregungspfad vom Sammelpfad unabhängig wird, wird die maximale Frequenz des Beleuchtungsmusters nicht mehr durch das Detektionsobjektiv eingeschränkt.

Konzept von tSIM: (a) Schema des Versuchsaufbaus für eine Orientierung; (b) abstimmbare Frequenzbeleuchtungsmuster werden durch ein Paar Spiegelfacetten erzeugt, die einer Niederfrequenz- bzw. Hochfrequenzbeleuchtung entsprechen; (c) Schema der Polarisationsumwandlung der interferierenden Strahlen, wobei das obere, mittlere und untere Feld dem Polarisationszustand über, auf bzw. unter der Wirbelhalbwellenplatte entspricht; (d) hexagonale Anordnung der Spiegelfacetten für drei Orientierungswinkel, die für die Verbesserung der isotropen Auflösung erforderlich sind; (e) Auflösungsgrenze, dargestellt durch die optische Übertragungsfunktion (ausgefüllter Kreis), maximale Verschiebung (gepunkteter Kreis) bei herkömmlichen SIM-Karten bietet eine zweifache Auflösungsverbesserung. (f) maximale spektrale Unterstützung von tSIM, bestimmt durch die Periodizität \(\frac{\lambda }{{2\sin {\theta _1}}}\, einstellbar unter verschiedenen Störwinkeln \(\theta\); (g, h) Frequenzunterstützung einer Detektionsobjektivlinse mit niedriger NA unter ähnlichen Beleuchtungskonfigurationen, wobei tSIM mehr unterstützt als die herkömmliche 2-fache Auflösungsverbesserung von SIM. Die in (a, b, d) gezeigten 3D-Grafiken wurden mit einer kostenlosen Open-Source-Software für 3D-Computergrafiken, Blender (Version 3.2, https://www.blender.org/), entworfen.

Die grafische Darstellung des Versuchsaufbaus ist in Abb. 1a dargestellt. Der Eingangslaser ist parallel zum optischen Tisch ausgerichtet und wird durch ein HWP nullter Ordnung übertragen, um das Licht parallel zum optischen Tisch zu polarisieren. Anschließend wird es von einem um \(45^{\circ }\) geneigten Spiegel in vertikaler Richtung reflektiert, wobei die Polarisation parallel zur Spiegeloberfläche verläuft. Um das System kompakt zu machen, wird ein physikalisches Gitter verwendet, um das Eingangslicht zu teilen, wobei die gebeugten Strahlen erster Ordnung nach der Reflexion durch ein Paar Kippspiegel in Richtung der optischen Achse (z) gerichtet werden. Die Neigungswinkel des gegenüberliegenden Spiegelpaars werden so eingestellt, dass sich die reflektierten Strahlen in einem kleinen Volumenbereich überlappen und so ein sinusförmiges Interferenzmuster erzeugen. Sofort wird ein Paar Kippspiegel zum Sammeln der ersten Beugungsordnungen vom Gitter eingesetzt. Für die Isotropie ist es erforderlich, die Gitterrotation und die entsprechende Sammlung der gebeugten Ordnungen durch andere Kippspiegelpaare einzubeziehen. Der Zweck der Kondensorlinse wird durch den Satz Kippspiegel effektiv erfüllt. Dieses einzigartige linsenlose Beleuchtungsschema bietet potenzielle Vorteile bei der Erzeugung aberrationsfreier strukturierter Muster, die über das gesamte Interferenzvolumen homogen sind. Außerdem wird der Beleuchtungsbereich nicht mehr durch die Kondensorlinse begrenzt; Vielmehr wird es durch den Durchmesser der interferierenden Strahlen bestimmt, die im Ergänzungstext T1 beschrieben sind. Die Probe wird innerhalb des volumetrischen Bereichs gehalten, um mit dem Anregungsmuster beleuchtet zu werden, und ein Standard-Aufrechtmikroskop wird verwendet, um das Fluoreszenzsignal von der anderen Seite der Probe zu sammeln. Die maximale Ortsfrequenzunterstützung der Durchleuchtungs-SIM-Technik wird durch Berücksichtigung der resultierenden Beiträge der Erkennung und der Beleuchtungskonfiguration bestimmt.

Das Detektionssystem bestehend aus einer Linse mit numerischer Apertur (NA) und Emissionswellenlänge \(\lambda _{em}\) ist durch die klassische Beugungsgrenze \(\left| {\mathbf {k}}_{det}\ eingeschränkt. rechts| = \frac{2\text{ NA }}{\lambda _{em}}\). Andererseits hängt die Beleuchtungsfrequenz \(\left| {\mathbf {k}}_{illu}\right| = \frac{2nsin\theta }{\lambda _{ex}}\) ausschließlich von der Interferenz ab Bedingungen, bei denen \(\lambda _{ex}\) die Spitzenanregungswellenlänge und \(\theta\) der Halbinterferenzwinkel zwischen den interferierenden Strahlen innerhalb eines Mediums mit dem Brechungsindex n ist. Daher wird die theoretische laterale Auflösungsgrenze des tSIM auf Kippspiegelbasis wie folgt bestimmt:

Der Halbwinkel der Interferenz (\(\theta = 2\delta + \alpha\)) wird durch den Beugungswinkel (\(\alpha\)) des Gitters und die Neigung (\(\delta\)) bestimmt des Spiegels in Bezug auf die Optikachse. Die Abstimmung des Neigungswinkels des Spiegels führt zu einer Änderung des Interferenzwinkels und auch der Musterfrequenz. Daher ist die Technik in der Lage, abhängig von den Anforderungen des Beleuchtungsschemas sinusförmige strukturierte Muster mit abstimmbarer Frequenz zu erzeugen. Diese besondere Eigenschaft ist im Vergleich zu den bisher existierenden Standard-SIM-Technologien ziemlich einzigartig. Die Nahaufnahme innerhalb des gelben Kastens in Abb. 1a ist in Abb. 1b dargestellt und zeigt das Winkelabstimmungsschema für die Beleuchtung. Die gewünschte Phasenverschiebung des Interferenzmusters in der Probenebene wird durch die Verschiebung des physikalischen Gitters entlang der lateralen Richtung (entlang der Gitterperiode) mit einem einachsigen Piezo-Translationstisch berücksichtigt. Der Piezotisch ist mit einem motorisierten Rotationstisch gekoppelt, der die Ausrichtung des Gitters ändert, um Isotropie in die Beleuchtungsmuster zu integrieren. Um das Beleuchtungsmuster höchster Modulationstiefe zu erzeugen, werden die Polarisationszustände der interferierenden Strahlpaare vor dem Auftreffen auf die Spiegel geeignet umgewandelt. Abbildung 1c stellt das Umwandlungsschema des Polarisationszustands dar: linear polarisierter Eingang (unteres Feld), Vortex-Halbwellenplatte als Polarisationskonverter (mittleres Feld) und azimutal polarisierter Ausgang (oberes Feld). Der Wirbel HWP ist entsprechend ausgerichtet, um in jeder der drei Ausrichtungen das bestmögliche Interferenzmuster zu erzielen. Neben der Ausrichtung der interferierenden Strahlpaare, die parallel zueinander polarisiert sind, nutzt ein solches Konvertierungsschema die Eingangsleistung effizient aus, indem es den Fresnel-Reflexionsverlust von den Spiegeloberflächen minimiert. Bisher drehte sich die Beschreibung des Aufbaus um das Anregungsmuster entlang einer Orientierung. Die sechseckige Anordnung der Kippspiegel soll eine sinusförmige Beleuchtung in drei verschiedenen Ausrichtungen erzeugen und so die isotrope Auflösung verbessern. Die Hexa-Anordnung der Spiegelfacetten ist in Abb. 1d dargestellt, wobei (M\(_{1}\), M\(_{1}^{'}\)), (M\(_{2 }\), M\(_{2}^{'}\)), (M\(_{3}\), M\(_{3}^{'}\)) entsprechen den drei Sätzen von Spiegelpaare. Um die Beleuchtungsfrequenz zu ändern, erfolgt die gleiche Abstimmung der Neigungswinkel jedes Spiegelpaars in einer Weise, dass sich der gemeinsame volumetrische Interferenzbereich nur in axialer Richtung verschiebt und dabei die gleiche seitliche Position beibehält. Wenn die Interferenz zwischen den Strahlpaaren bei einem kleinen Winkel (\(\theta\)) auftritt, wird eine große Musterperiode erzeugt, um einen geringen Auflösungsgewinn zu erzielen, während Interferenz bei einem großen Winkel eine relativ bessere Auflösung bietet. Die Fähigkeit zur Auflösungsverbesserung des herkömmlichen SIM wird durch die grauen Kreise in Abb. 1e dargestellt, was einer etwa zweifachen Verstärkung entspricht. Andererseits wird die Auflösungsverbesserung des vorgeschlagenen tSIM durch die Erweiterung der blauen, grünen und roten Kreise in Abb. 1f gezeigt, die dem Halbwinkel der Interferenz \(\theta = 20^{\circ }\ ), \(40^{\circ }\) bzw. \(60^{\circ }\). Die Einzelheiten des Versuchsaufbaus sind im Ergänzungstext T2 beschrieben. Jedes Bild wird mit 300 ms Belichtungszeit aufgenommen und die Aufnahme aller Bilder in drei Ausrichtungen dauert insgesamt 2700 ms. Die Drehung des Gitters dauert 750 ms, um in zwei andere Orientierungen zu wechseln. Daher dauert die gesamte Erfassung derzeit \(\sim\)3,5 s, was in Tabelle 1 dargestellt ist.

Der große Vorteil der tSIM-Technik kommt zum Tragen, wenn es um die Bildgebung mit großem Sichtfeld geht, bei der eine Objektivlinse mit geringer Vergrößerung und niedriger NA für die Erkennung verwendet wird. Ohne Änderung des Detektionsdurchlassbands (bei fester Objektivlinse) ist es möglich, Beleuchtungsmuster beliebiger Frequenz mit einer maximalen Grenze von \(\frac{2}{\lambda }\) in die Freiraumoptik zu integrieren. Abb. 1g stellt die Auflösungsverbesserung einer Objektivlinse mit niedriger NA im herkömmlichen SIM-Fall dar, während Abb. 1h den tSIM-Fall für die Beleuchtungsmuster variabler Ortsfrequenzen beschreibt. Obwohl ein Beleuchtungsmuster mit sehr hoher Frequenz (im Vergleich zur Low-NA-Durchlassbandgrenze) erreicht werden kann, um eine weitaus bessere Auflösung als bei herkömmlicher SIM zu erzielen, sind Zwischenfrequenzen aus niedrigeren Interferenzwinkeln erforderlich, um eine Lücke zu verhindern. Durch die Anpassung der Beleuchtungsmuster mit dem kippspiegelunterstützten Schema ist die Technik in der Lage, den erforderlichen Frequenzraum zu füllen und eine Auflösungsverbesserung ähnlich einer Objektivlinse mit hoher NA zusammen mit einem großen FOV zu bieten, das durch eine Detektionsobjektivlinse mit niedriger NA unterstützt wird .

Experimentelle Ergebnisse von fluoreszierenden Perlen: (a) Einzel-FOV-tSIM-Rekonstruktion und Weitfeldbild von 200-nm-fluoreszierenden Perlen; (b) beugungsbegrenzte Spektren; (c) rekonstruierte tSIM-Spektren; (d, f) vergrößerte Weitfeldbilder der White Box in den Regionen R\(_1\) bzw. R\(_2\); (e, g) Nahaufnahme der tSIM-Rekonstruktion in den Regionen R\(_1\) bzw. R\(_2\); (h) Intensitätslinienprofile von (d, e); (i) Intensitätslinienprofile von (f, g).

Um die Superauflösungsfähigkeit der vorgeschlagenen kippspiegelunterstützten strukturierten Beleuchtungsmikroskopie zu validieren, präsentieren wir Experimente für Polymerkügelchen sowie eine biologische Zellprobe. Für den Proof-of-Concept demonstrieren wir zunächst die experimentellen Ergebnisse für ein Szenario ähnlich dem herkömmlichen SIM-Fall, bei dem die Beleuchtungsfrequenz innerhalb der Durchlassbandgrenze des Erkennungssystems liegt. Als Anregungslichtquelle wird während der gesamten Studie ein CW-Laser mit einer Wellenlänge von 532 nm (DPSS 05-01, Cobolt Samba) verwendet.

tSIM-Bildgebung von Aktinfilamenten in U2OS-Zellen: (a) Einzel-FOV-tSIM-Rekonstruktion im Vergleich zu einem beugungsbegrenzten Bild mit den Anregungs-/Emissionswellenlängen von 532 nm/560 nm und Einschub zeigt Spektren des rekonstruierten Bildes; (b, d) beugungsbegrenzte Bilder der Regionen R\(_1\) und R\(_2\); (c, e) rekonstruiertes tSIM-Bild der Regionen R\(_1\) bzw. R\(_2\); (f, g) Intensitätsprofil einer zwischen den Pfeilspitzen in (c, e) markierten Linie.

Die interferierenden Strahlen überlappen sich im Halbinterferenzwinkel \(\theta = 19^{\circ }\), um das sinusförmige Beleuchtungsmuster mit der Periodizität \(\sim\)778 nm zu erzeugen. Die interferierenden Strahlen haben einen Durchmesser von \(\sim\)1 mm, um ein homogenes Beleuchtungsmuster über den gesamten Beleuchtungsbereich in der Probenebene zu erzeugen, das im Verhältnis zum Sichtfeld des Detektionssystems ausreichend groß ist. Als Detektionssystem wird ein standardmäßiges aufrechtes Fluoreszenzmikroskop verwendet, das aus einem Low-NA-Objektiv (PLN 20X/0,4, Olympus), einer passenden Tubuslinse (U-TLU, Olympus), einem Fluoreszenzfilter (550 nm Langpass, Semrock) und einer Digitalkamera mit rechteckigem Sensor (Hamamatsu ORCA spark, 1920\(\times\)1200 Pixel). Als fluoreszierende Probe werden die dünn verteilten fluoreszierenden Nanopartikel mit einem Durchmesser von 200 nm (Bangslabs) zwischen zwei Deckgläsern verwendet. Die Anregungs- und Emissionsspitzenwellenlänge des Fluorophors in den Perlen beträgt 540 nm bzw. 600 nm. Die Verwendung einer Low-NA-Sammlung ermöglicht die Bildgebung mit dem großen FOV von 0,56 mm Breite und 0,35 mm Höhe (erfasst durch einen rechteckigen Sensor). Nach dem herkömmlichen SIM-Ansatz werden drei rohe Moiré-Frames erfasst, indem das physikalische Gitter in Schritten von 0,55 μm verschoben wird, was zu einer Phasenverschiebung von 0, 2\(\pi\)/3 und 4\(\pi\) führt. /3 im Beleuchtungsmuster. Die Rohdaten für drei verschiedene Ausrichtungen werden nacheinander mithilfe von drei Kippspiegelpaaren in der sechseckigen Anordnung erfasst. Insgesamt werden 9 Bilder (3 Phasen \(\times\) 3 Ausrichtungen) rechnerisch verarbeitet, um das endgültige Bild zu erhalten. Zur Verarbeitung der tSIM-Rohdaten wird der Open-Source-Rekonstruktionsalgorithmus „OpenSIM“39 angewendet. Das rekonstruierte Bild der fluoreszierenden Perlen und das entsprechende beugungsbegrenzte Weitfeldbild sind in Abb. 2a dargestellt. Das Leistungsspektrum des Weitfeldbildes ist in Abb. 2b dargestellt, während die gesammelten tSIM-Spektren in Abb. 2c dargestellt sind. Die Details der getrennten Spektralkeulen sind im Ergänzungstext T4 dargestellt. Die vergrößerten Ansichten der White-Box-Region R\(_1\) sind in Abb. 2d, e dargestellt und entsprechen dem Weitfeld- bzw. dem rekonstruierten tSIM-Bild. Das Intensitätslinienprofil über die Perlen in dem durch das Magenta-Feld markierten Bereich ist in Abb. 2h dargestellt. Die vergrößerten Details einer anderen Region R\(_2\) werden in Abb. 2f angezeigt, wobei g dem Weitfeld bzw. dem rekonstruierten Bild entspricht. Abbildung 2i zeigt das Linienscan-Profil über zwei fluoreszierende Perlen im Blue-Box-Bereich. Da das FOV recht groß ist, wird im Ergänzungstext T3 die Analyse mehrerer solcher Zoom-In-Regionen gezeigt, um die homogene Auflösungsverbesserung über das gesamte FOV zu verifizieren. Die Verbesserung der Auflösung ist deutlich an den Intensitätslinienprofilen zu erkennen, wo die kontinuierliche Intensitätsverteilung über zwei Perlen im Weitfeldbild nach der tSIM-Rekonstruktion als zwei isolierte Partikel erscheint (Abb. 2 (h, i)). Die theoretische Grenze der räumlichen Auflösung des Mikroskopiesystems wird auf 750 nm geschätzt. Somit wird bestätigt, dass die Abstände über 430 nm durch tSIM unter herkömmlichen SIM-Bedingungen bei einem großen FOV von 0,56 mm\(\times\)0,35 mm (beschränkt durch die Größe des Bildsensors) aufgelöst werden.

Hochfrequenz-tSIM-Bildgebung einer Aktin-gefärbten U2OS-Zelle: (a) Einzel-FOV-tSIM-Rekonstruktion und beugungsbegrenztes Bild mit den Anregungs-/Emissionswellenlängen von 532 nm/560 nm und Einschub zeigt Spektren des rekonstruierten Bildes; (b, d) Weitfeldbild der Regionen R\(_1\) bzw. R\(_2\); (c, e) rekonstruiertes Bild der Regionen R\(_1\) bzw. R\(_2\); (f, g) Intensitätslinienprofile zwischen den magentafarbenen und blauen Pfeilspitzen.

Simulationsergebnis der Hochfrequenz-tSIM-Bildgebung unter Verwendung synthetischer fluoreszierender Partikel: (a) Einzel-FOV-tSIM-rekonstruiertes Bild und Weitfeldbild unter Verwendung einer 20X/0,65-Detektionsobjektivlinse und Einschub zeigt Spektren des rekonstruierten Bildes; (b, f) Grundwahrheitsobjekt der Regionen R\(_1\) und R\(_2\); (c, g) Weitfeldbild der Regionen R\(_1\) und R\(_2\); (d, h) rekonstruiertes Bild der Regionen R\(_1\) und R\(_2\); (e, i) Intensitätslinienprofile innerhalb des gelben Kastens.

Darüber hinaus untersuchen wir die Machbarkeit der Technik für eine reale Anwendung anhand einer biologischen Probe. U2OS-Zellen (menschliches Knochenosteosarkom) werden auf Glasdeckgläsern ausgesät, permeabilisiert, auf Aktinfilamente gefärbt und oben mit einem weiteren Glasdeckglas versiegelt. Auch hier kommt das 20X/0,4-Objektiv zum Einsatz, um gleichzeitig mehr als 50 Zellen innerhalb des großen FOV (0,56 mm Breite und 0,35 mm Höhe) aufzuzeichnen. Die Probenbildgebung wird in einem interessierenden Bereich durchgeführt, in dem die Konzentration der Zellen mäßig ist. Die rohen Moiré-Bilder werden unter den gleichen Bildgebungsbedingungen aufgenommen, wie sie für die fluoreszierenden Perlen beschrieben wurden. Der Rekonstruktionsalgorithmus „OpenSIM“39 ist auch in diesem Beispiel implementiert, wobei das Weitfeld und das entsprechende rekonstruierte tSIM-Bild in Abb. 3a dargestellt sind. Der Einschub in Abb. 3a stellt die Ortsfrequenzspektren des rekonstruierten tSIM-Bildes dar. Die Abb. 3b, d stellen die Details des Weitfeldbildes aus den White-Box-Regionen R\(_1\) bzw. R\(_2\) dar. Die einzelnen FOV-tSIM-Bilder, die diesen Regionen entsprechen, sind in Abb. 3c dargestellt, z. Das Intensitätslinienprofil von Abb. 3c (markiert durch die magentafarbenen Pfeilspitzen) ist in Abb. 3f dargestellt. In ähnlicher Weise ist in Abb. 3g ein weiteres Linienprofil von Abb. 3e (markiert durch die blauen Pfeilspitzen) dargestellt. Die Intensitätslinienprofilmessungen einiger weiterer Regionen werden im Ergänzungstext T5 vorgestellt. Die Merkmale, die im Weitfeldbild als gleichmäßige Verteilung erscheinen, werden im rekonstruierten Bild aufgelöst, wobei die Spitzen in den Intensitätsprofilen die Auflösungsverbesserung von tSIM für die Bioproben zeigen.

Bisher haben wir tSIM-Ergebnisse mit herkömmlichen Beleuchtungsbedingungen gezeigt. Nun präsentieren wir ein Beispiel, bei dem tSIM den herkömmlichen linearen SIM-Auflösungsgewinn um das Zweifache übertrifft, der durch die Implementierung einer Hochfrequenzbeleuchtung mit einer Musterfrequenz außerhalb der Erkennungs-Durchlassbandgrenze erreicht wird. Der Winkel der Kippspiegel ist so abgestimmt, dass der Halbwinkel der Interferenz \(\theta\) = 35\(^{\circ }\) beträgt. Dies ermöglicht die Erzeugung eines Interferenzmusters mit einer Periodizität von 464 nm in der Probenebene, das unterhalb der Beugungsgrenze des Detektionssystems liegt und daher keine Streifen beobachtet werden können. Die rohen Moiré-Daten werden unter Beibehaltung des gleichen Detektionsobjektivs (20X/0,4) sowie der zuvor genannten Bildgebungsparameter erfasst. Wie zuvor wurden insgesamt 9 Rohbilder (3 Phasen \(\times\) 3 Orientierungen) aufgezeichnet. Allerdings haben die herkömmlichen Rekonstruktionsansätze39,40 in diesem speziellen Fall Probleme bei der Verarbeitung der Rohdaten, da die Beleuchtungsfrequenz außerhalb der Durchlassbandunterstützung liegt. Dies wird durch die Verwendung eines TIRF-SIM-ähnlichen Rekonstruktionsansatzes überwunden39. Das rekonstruierte und entsprechende Weitfeldbild ist in Abb. 4a dargestellt. Der Einschub in Abb. 4a stellt die Frequenzspektren des rekonstruierten tSIM-Bildes dar. Die außermittigen Spektralkomponenten (gelb gepunktet markiert) überlappen sich nicht, was die Abdeckung des breiteren Spektralbereichs aufgrund hochfrequenter Beleuchtungsmuster zeigt. Abbildung 4b, d stellt ein Weitfeldbild von zwei vergrößerten Regionen R\(_1\) bzw. R\(_2\) dar. Ihre entsprechenden superaufgelösten Bilder sind in Abb. 4c dargestellt, z. Die Intensitätslinienprofile zwischen den magentafarbenen Pfeilspitzen in Abb. 4b, c und den blauen Pfeilspitzen in Abb. 4b, c sind in Abb. 4f bzw. Abb. 4 g dargestellt. Dies führt zu einer Auflösung von \(\sim\)290 nm mit einem FOV der Größe 0,56 mm\(\times\)0,35 mm. Die Auflösungsverbesserung von tSIM unter verschiedenen Beleuchtungskonfigurationen im Hinblick auf die spektrale Unterstützung wird im Ergänzungstext T6 vorgestellt. Es wird eine Simulationsstudie vorgestellt, bei der eine Objektivlinse mit geringer Vergrößerung/hoher NA und Beleuchtung mit hohem Neigungswinkel verwendet wird, um eine weitere Verbesserung der Auflösung bei gleichem Sichtfeld zu demonstrieren. Zur Sammlung wird eine 20X/0,65-Objektivlinse verwendet und der Halbinterferenzwinkel wird auf \(\theta\) = 70\(^{\circ }\) gehalten, was einer effektiven NA von 0,93 entspricht. Als synthetisches Testziel wird eine zufällige Nanopartikelverteilung mit einem Durchmesser von 80 nm gewählt. Das Simulationsergebnis der Einzel-FOV-tSIM-Rekonstruktion und des beugungsbegrenzten Bildes für 500-nm-Emission ist in Abb. 5a dargestellt. Der Einschub zeigt Frequenzspektren des rekonstruierten tSIM-Bildes. Die Abb. 5b, f stellen zwei vergrößerte Bereiche des Ground-Truth-Objekts dar und Abb. 5c, g stellen entsprechende Weitfeldbilder aus den White-Box-Bereichen R\(_1\) bzw. R\(_2\) dar. Die einzelnen FOV-tSIM-rekonstruierten Bilder, die diesen Regionen entsprechen, sind in Abb. 5d, h dargestellt. Das Intensitätslinienprofil von Abb. 5d (markiert durch gelbes Quadrat) ist in Abb. 5e dargestellt. In ähnlicher Weise ist in Abb. 5i ein weiteres Linienprofil von Abb. 5h (markiert durch das gelbe Quadrat) dargestellt. Dies zeigt die Auflösung bis hinunter zu 160 nm unter Beibehaltung des gleichen FOV (0,56 mm\(\times\)0,35 mm) des 20X-Objektivs, das in den vorherigen Fällen beschrieben wurde.

Die gesamte vorherige Diskussion dreht sich um die Sammlung mit geringer NA, die Bildgebung mit großem Sichtfeld, einstellbare Beleuchtungsmuster und die entsprechende Superauflösung. Es wird jedoch erwähnt, dass sich die Gesamtauflösung aus den gemeinsamen Beiträgen von Beleuchtung und Erkennung ergibt. Abschließend wird die Superauflösungsfähigkeit des tSIM unter Verwendung des Detektionsobjektivs mit hoher Vergrößerung und hoher NA demonstriert. Wir wechseln zur Erfassung des Fluoreszenzsignals zu einer 100X/1,3-Ölimmersionsobjektivlinse (Olympus), während die anderen Bildgebungskomponenten (z. B. Fluoreszenzfilter, Kamerasensor) wie in den vorherigen Fällen beschrieben beibehalten werden. Auch in diesem Fall wird die gleiche Probe (mit Alexa-Fluor 532 gefärbte U2OS-Zellen) verwendet. Der Halbwinkel der Interferenz beträgt \(\theta\)=\(45^{\circ }\), was zur Erzeugung von Interferenzstreifen mit einem Abstand von jeweils 376 nm in der Probenebene führt. Dies führt zu einem Beleuchtungsfall ähnlich einem herkömmlichen SIM mit Objektivlinse mit hoher NA und die Rohdaten werden auf die gleiche Weise aufgezeichnet, wie in früheren Fällen beschrieben. Das Weitfeldbild ist in Abb. 6a dargestellt, während das entsprechende tSIM-Bild in Abb. 6b dargestellt ist. Abbildung 6c, e stellen die vergrößerten Ansichten des Weitfeldbildes in den Regionen R\(_1\) bzw. R\(_2\) dar. Die Nahaufnahme der tSIM-Bilder ist in Abb. 6d bzw. f dargestellt. Die Intensitätslinienprofile zwischen den magentafarbenen Pfeilspitzen in Abb. 6c, e und den blauen Pfeilspitzen in Abb. 6d, f sind in Abb. 6g bzw. Abb. 6 h dargestellt.

Experimentelle Ergebnisse von Aktinfilamenten von U2OS-Zellen, gefärbt mit Alexa-Fluor 532: (a) Weitfeldbild; (b) tSIM-Rekonstruktionsbild; (c, d) vergrößerte Weitfeldbilder der White Box in den Regionen R\(_1\) bzw. R\(_2\); (e, f) Nahaufnahme der tSIM-Bilder in den Regionen R\(_1\) bzw. R\(_2\); (g) Intensitätslinienprofile von (c, e), dargestellt durch Magentafarbe; (h) Intensitätslinienprofile von (d, f), dargestellt durch blaue Farbe.

Somit verbessert die Verwendung einer Detektionsobjektivlinse mit hoher NA die Auflösung des Detektionssystems und die Anwendung von tSIM verringert die Auflösungsskala weiter auf und \(\sim\)160 nm für \(\theta\) = \(45^{\circ }\). Für eine vergleichende Analyse führen wir das Experiment für den Beleuchtungswinkel \(\theta\)=\(35^{\circ }\) durch und beobachten, dass die Auflösung \(\sim\)190 nm beträgt, und die entsprechenden Ergebnisse werden beschrieben im Ergänzungstext T7. Allerdings geht die Superauflösung bei der Verwendung eines Detektionsobjektivs mit hoher NA (100X/1,3) auf Kosten des FOV, d. h. 0,11 mm\(\times\)0,07 mm, was für beide Beleuchtungsfälle mit \(\theta) gleich bleibt \) = \(35^{\circ }\) sowie \(\theta\) = \(45^{\circ }\). Die Superauflösungsfähigkeit des tSIM mit verschiedenen Beleuchtungs- und Erkennungskonfigurationen ist in Tabelle 2 dargestellt und einige zusätzliche Details sind im Ergänzungstext T8 enthalten.

Abschließend demonstrieren wir die experimentellen Proof-of-Concept-Ergebnisse der kippspiegelunterstützten Transmissionsstrukturbeleuchtungsmikroskopie (tSIM), die die Beleuchtung und die Detektionsoptik flexibel macht, um sie unabhängig voneinander zu konfigurieren. Der Kippspiegel ermöglicht die Erzeugung von Beleuchtungsmustern mit abstimmbaren Frequenzen, die von potenzieller Bedeutung sind, um je nach Anforderung einen Auflösungsgewinn zu erzielen. Mithilfe der Low-NA-Erkennung wird ein einzelnes großes FOV-Bild mit einer Größe von 0,56 mm\(\times\)0,35 mm (hauptsächlich begrenzt durch die Sensorgrenze) erhalten und wir demonstrieren zunächst eine \(\sim\)1,7-fache Verbesserung der Auflösung ( herkömmliches SIM) durch tSIM über der Beugungsgrenze. Die experimentelle Überprüfung erfolgt sowohl für die fluoreszierenden Perlen als auch für biologische Proben. Darüber hinaus wird durch die Nutzung des Hochfrequenz-Beleuchtungsmusters (Frequenzspitze außerhalb des Detektionsdurchlassbands) eine \(\sim\)2,4-fache Auflösungsverbesserung über tSIM bei gleichem FOV erreicht. Darüber hinaus führen wir eine Simulationsstudie durch, um die Möglichkeit zu untersuchen, die Auflösung durch den Einsatz eines Sammelobjektivs mit geringer Vergrößerung/hoher NA und einer Beleuchtung mit hohem Neigungswinkel weiter zu verbessern. Es wird beobachtet, dass die herkömmliche Rekonstruktion die Rohdaten nicht verarbeiten kann, wenn die Beleuchtungsfrequenz außerhalb des Detektionsdurchlassbands liegt. Wir haben TIRF-SIM-ähnliche Rekonstruktionsansätze39,41 für unsere Rekonstruktion implementiert, es gibt jedoch Möglichkeiten, blinde42,43 Ansätze zu erkunden, die keine Vorkenntnisse der Beleuchtungsmuster erfordern. Darüber hinaus könnten die Deep-Learning-basierten44,45 Algorithmen eine potenzielle Anwendung bei der tSIM-Rekonstruktion bieten. Die experimentelle Demonstration des tSIM für die fluoreszierenden Perlen liefert das perfekte Ergebnis. Die Rekonstruktion der Aktinfilamente enthält jedoch eine Art Wabenartefakte46, die auf Photobleichung und ein schlechtes Signal-Rausch-Verhältnis zurückzuführen sind. Solche Artefakte in der Rekonstruktionsbildgebung treten häufig in Standard-SIM-Bildern auf, allerdings ist die Fluoreszenz für die Kügelchenprobe hell und stabil und solche Artefakte wurden nicht beobachtet. Die Machbarkeit von tSIM wird durch ein Detektionsobjektiv mit hoher NA und einer Auflösung von bis zu \(\sim\)160 nm durch Kompromisse beim FOV gerechtfertigt.

Das System ist im Vergleich zu den typischen SIM-Systemen sehr kompakt. Das System benötigt derzeit \(\sim\)3,5 s für die gesamte Erfassung. Die Geschwindigkeit wird im Wesentlichen durch die Helligkeit der Probe begrenzt, da eine Erfassungszeit von 3 ms–10 ms möglich ist, indem hellere fluoreszierende Proben verwendet werden, was das System möglicherweise in Richtung einer Hochgeschwindigkeitserfassung (\(\sim\)0,8 s) ankurbelt, die für kompatibel ist Live-Cell-Bildgebung über ein großes FOV (0,56 mm\(\times\)0,35 mm). Die im Versuchsaufbau zur Abstimmung der Kippspiegel beschriebenen Mikrometerschrauben wurden manuell betätigt. Die geringfügige Abweichung der Musterfrequenz aufgrund einer geringfügigen Abweichung in der Ausrichtung der Mikrometerschrauben wurde während des Rekonstruktionsprozesses (Frequenzschätzungsschritt) berücksichtigt. Durch den Ersatz dieser Schraubenköpfe durch motorisierte Versionen würde das System jedoch vollständig computergesteuert, präzise, ​​schneller und einfacher zu bedienen sein. Durch die Verwendung eines Mediums mit hohem Brechungsindex in der Beleuchtungskonfiguration können Subbeugungsstreifenmuster erzeugt werden, die in Freiraumoptiken nicht zu realisieren sind. Dies könnte möglicherweise zur weiteren Verbesserung der Auflösung von tSIM genutzt werden. Verschiedene Anregungsquellen können in das System gekoppelt werden, um verschiedene Fluorophore für die mehrfarbige SIM-Bildgebung zu untersuchen16,47. Dennoch besteht die Möglichkeit, die vorgeschlagene Technik für die 3D-SIM17,48-Bildgebung zu erweitern, indem der Zentralstrahl in die tSIM-Architektur eindringt. In herkömmlichen SIM-Systemen sind Beleuchtung und Sammlung gekoppelt. Um die kleine Streifenperiode (hohe Ortsfrequenz) zu erhalten, sollten die beiden interferierenden Strahlen daher auf den Rand der hinteren Apertur einer bestimmten Objektivlinse treffen. Daher muss jedes Mal, wenn eine neue Objektivlinse für die Bildgebung verwendet wird, die optische Anordnung geändert werden, um die höchste von den verschiedenen Objektivlinsen unterstützte Ortsfrequenz zu nutzen. Folglich verfügt das kommerzielle SIM-System normalerweise über eine vordefinierte Einzelobjektivlinse mit hoher Vergrößerung und NA. Dies beschränkt das Sichtfeld kommerzieller SIM-Systeme auf etwa \(50\times 50\) μm2. Das tSIM unterstützt sowohl das große als auch das benutzerdefinierte FOV durch einfachen Wechsel zu einem anderen Detektionsobjektiv, ohne den Beleuchtungslichtweg zu beeinflussen. Die große FOV-Unterstützung von tSIM wird Anwendungen finden, bei denen ein hoher Durchsatz unerlässlich ist, beispielsweise in der Histopathologie49,50. In ähnlicher Weise wird tSIM Neuroimaging-Anwendungen zugute kommen, bei denen Daten sowohl räumlich als auch zeitlich korreliert werden müssen, indem große Bereiche abgebildet werden51.

Das Deckglas wurde mit verdünntem Aceton gespült und mit entionisiertem Wasser gereinigt. Anschließend wurde es mit Isopropylalkohollösung behandelt und erneut mit entionisiertem Wasser gereinigt. Dann wurde es mit komprimiertem Stickstoffgas getrocknet. Eine kleine Menge (0,5 μl) Fluoreszenzkügelchenlösung mit 200 nm Durchmesser (Suncoast Yellow, FSSY002 Banglabs) wurde herauspipettiert und vorsichtig auf das gereinigte Deckglas gegossen. Anschließend wurde das Deckglas geneigt gehalten und anschließend vollständig trocknen gelassen. Bei dieser Art der Trocknung zieht die Schwerkraft den Tropfen und die Oberkante während der Flüssigkeitsverdunstung nach unten, wodurch der „Kaffee-Ring-Effekt“ verringert wird. Ein kleiner Tropfen Glycerin wurde auf ein anderes Deckglas mit größerer Länge gegeben; Nachdem eine Kante des Deckglases mit den Kügelchen mit dem größeren Deckglas berührt wurde, wurde die andere Kante langsam abgesenkt, bis sie vollständig flach auf dem Glycerin lag. Während dieses Vorgangs war die Probenseite des kleinen Deckglases dem Glycerin zugewandt, so dass die Probe zwischen zwei Deckgläsern eingeschlossen wurde. Das Glycerin konnte sich ohne Druck ausbreiten und die Grenze zwischen zwei Deckgläsern wurde mit Nagellack versiegelt. Nach dem Trocknen der Farbe wurde die Probe zur Bildgebung unter ein Mikroskop gelegt.

Osteosarkom-U2OS-Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, hoher Glucosegehalt, Sigma-Aldrich), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (Sigma-Aldrich) und 1 % Penicillin/Streptomycin (Sigma-Aldrich), bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert . Zellen (15–20 % Konfluenz) wurden auf #1,5-Glasdeckgläsern (22 mm\(\times\)22 mm, VWR) ausgesät und vor der Bildgebung einen Tag lang inkubiert. Dann wurden die Zellen in PBS gewaschen, 10 Minuten lang mit 4 % Formaldehyd (FA, ThermoFisher) in PBS fixiert, dreimal in PBS gewaschen und anschließend 10 Minuten lang mit 0,1 % TritonX-100 (Sigma-Aldrich) in PBS zur Permeabilisierung behandelt. und dreimal in PBS gewaschen. Anschließend wurden die Zellen mit Alexa FluorTM 532 Phalloidin (1:50 in PBS, ThermoFisher) 20 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) inkubiert, um f-Actin in den Zellen zu markieren. Dreimal in PBS waschen, bevor mit ProLong\(^{\mathrm {TM}}\) Glass Antifade Mountant (ThermoFisher) auf Glasobjektträgern/Deckgläsern (24 mm\(\times\)50 mm, VWR) bei RT über Nacht montiert wird. Die Proben sind dann für die Bildgebung bereit.

Die rohen Moiré-Bilder wurden mit einem aufrechten modularen Mikroskop (BXFM, Olympus) aufgenommen. Der für die Bildgebung verwendete Emissionsfilter ist der 550 nm Langpass-Fluoreszenzfilter (Semrock). Die Drehung des Gitters erfolgte mit einem motorisierten Rotationstisch (Holmarc). Das physische Gitter wurde auf einem einachsigen Translationstisch montiert und dieser Tisch einschließlich Gitter wurde zusammen mit dem Rotationstisch befestigt. Der lineare Piezo-Translationstisch (NF15AP25/M, Thorlabs) wird entlang einer bestimmten Richtung betrieben, um eine geeignete Phasenverschiebung in das Beleuchtungsmuster einzuführen, und eine Folge von Bildern wird entsprechend aufgezeichnet. Der Aufnahmevorgang wird für drei verschiedene Ausrichtungen wiederholt, indem das Gitter mithilfe des Rotationstisches (MPR-SSHR-50, Holmarc) um die optische Achse gedreht wird.

Die rechnerische Bildverarbeitung, also die Rekonstruktionsschritte, werden ausschließlich mit MATLAB R2020b durchgeführt, ausgeführt auf einer Computer-Workstation mit Windows 10 (Intel Xeon(R) W-2175 CPU, 2,50 GHz, RAM 64 GB). Zunächst wird der Rohdatensatz durch einen benutzerdefinierten Algorithmus driftkorrigiert. Anschließend wird ein Open-Source-Paket (Open-SIM) verwendet, um aus den driftkorrigierten Daten das hochauflösende Bild zu erhalten. Der zugehörige Code namens TIRF-SIM im selben Paket wird für die Rekonstruktion von Daten verwendet, bei denen die Beleuchtungsfrequenz außerhalb des Erkennungsdurchlassbands liegt.

Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Die Autoren danken Hong Mao, Deanna Wolfson und Florian Ströhl für ihre Unterstützung bei der Probenvorbereitung und den Diskussionen über die SIM-Rekonstruktion. Diese Arbeit wird vom Indo Norwegian Collaborative Program (Projektnummer – INCP 2014/10024), dem Forschungsrat von Norwegen, INTPART-Projektnummer – 309802, der University Grants Commission (UGC, Indien), der Defense Research and Development Organization (RP03707G, DRDO) unterstützt ). Die Publikationskosten für diesen Artikel werden durch einen Zuschuss aus dem Publikationsfonds der UiT The Arctic University of Norway finanziert.

Fachbereich Physik, Indian Institute of Technology Delhi, Neu-Delhi, 110016, Indien

Krishnendu Samanta & Joby Joseph

Fachbereich Physik und Technologie, UiT – The Arctic University of Norway, 9037, Tromsö, Norwegen

Krishnendu Samanta, Azeem Ahmad, Jean-Claude Tinguely und Balpreet Singh Ahluwalia

Zentrum für Optik und Photonik, Indian Institute of Technology Delhi, Neu-Delhi, 110016, Indien

Joby Joseph

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JJ und BSA hatten die Idee. KS, JT und AA haben die Kippspiegelhalterung entworfen, die Proben vorbereitet, die Experimente durchgeführt und Rekonstruktionen durchgeführt. JJ und BSA überwachten die gesamte Arbeit. Alle Autoren nahmen an den Diskussionen teil, um die Forschung und Analyse zu gestalten und das Manuskript zu erstellen.

Korrespondenz mit Balpreet Singh Ahluwalia oder Joby Joseph.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Eingegangen: 02. Oktober 2022

Angenommen: 09. Januar 2023

Veröffentlicht: 26. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-27814-x

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